Новые стратегии, сочетающей массив CGH, всего exome последовательности и в утробе матери электропорации грызунов для выявления причинных генов для пороки развития головного мозга
Summary
Перивентрикулярной узловой heterotopia (НПГ) является наиболее распространенной формой пороки развития коры головного мозга (MCD) в зрелом возрасте, но его генетической основы остается неизвестным в наиболее спорадических случаев. Недавно мы разработали стратегию выявления роман кандидат генов для МОРС и непосредственно подтвердить их причинных роль в естественных условиях.
Abstract
Врожденные дефекты, которые включают головного мозга — также известен как пороки развития коры головного мозга (MCD) — являются важными причинами умственной инвалидности и составляют 20-40% лекарственно-эпилепсии в детстве. Изображений с высоким разрешением мозга способствовала в естественных условиях идентификации большой группы MCD фенотипов. Несмотря на успехи в томографии головного мозга, геномного анализа и генерации животных моделей отсутствует простой рабочий процесс для систематически приоритеты кандидата генов и тестирования функциональных последствий предполагаемого мутаций. Для преодоления этой проблемы, экспериментальной стратегии, позволяющие идентифицировать Роман причинных генов для MCD разработан и проверен. Эта стратегия основана на выявления геномной регионах кандидат или генов через массив CGH или целое exome секвенирования и характеризующих последствия их инактивации или гиперэкспрессия специфических мутаций в разработке грызунов мозги через в утробе матери Электропорация. Этот подход привел к выявлению гена C6orf70 , кодирование для предполагаемого везикулярного белка, в патогенезе перивентрикулярной узловой heterotopia, МКД, вызванных дефектных миграции нейронов.
Introduction
Коре играет ключевую роль в процессах когнитивных и интеллектуальной и участвует в эмоциональной регуляции, а также обучения и памяти. Поэтому не удивительно, что многие неврологические и психические заболевания в результате пороков развития коры головного мозга (MCD). Этиология MCD сложной так как приобрел и генетических факторов. Накопительное распространения генетически детерминированных доля MCD составляет около 2%, и они являются спорадические в большинстве случаев. Например распространенность врожденных мозга дисгенезия оценивается выше, чем 1% населения, и некоторые виды MCD наблюдаются в более чем 14% всех пациентов с эпилепсией и 40% тяжелой или неразрешимыми эпилепсии1, 2.
Перивентрикулярной узловой Heterotopia (НПГ) является одним из наиболее распространенных MCDs и вызвано ненормальное миграции нейронов из желудочков зоны (VZ) для развивающихся коры головного мозга. Неспособность нейронов переносить результаты в кластерах heterotopic нейронов вдоль стены боковых желудочков, которые обычно могут быть визуализированы с помощью магнитно-резонансной томографии (МРТ). Клинико-анатомических и изображений функции НПГ неоднородны. Конкреций могут варьироваться от небольших и односторонних двусторонних и симметричный. Общие клинические осложнения включают эпилепсию и интеллектуальной инвалидностью3. Мутации в гене Filamin A (или FLNA), которая сопоставляет в Xq28, были найдены в 100% семей с Х-хромосомой двусторонних НПГ и 26% спорадических больных3,4. Редкие, рецессивный форма НПГ, вызванных мутациями в гене ARFGEF2 , который карты в 20q13, были зарегистрированы в двух кровосмесительных семей5. Недавно в девяти больных, пострадавших от мультисистемной расстройство, которое включает в себя НПГ6было выявлено biallelic мутации генов, кодирующих рецептор лиганд Кадгерины пара DCHS1 и FAT4 . НПГ также было связано с ломкой Х синдром7, Уильямс синдром8, 22q11 микроделеций синдром9, дублирования 5 p 1510, удалений в 1 p 3611, 5q14.3-q1512, 6 p 2513 и 6q терминала исключить синдром14,15,16,17,18,19, предполагая, что дополнительные причинных генов разбросаны на протяжении всего генома. Однако для примерно 74% больных спорадических НПГ генетическую основу остается проясненного17.
Классические Джин сопоставления подходы, такие, как массив Сравнительная геномная гибридизация (массив CGH) доказали, что мощные инструменты для обнаружения югу микроскопических хромосомных аномалий, однако геномные регионов, выявленных с помощью этого подхода часто большие и содержат многочисленные гены.
Появление массивной параллельной последовательности методов (то есть целое-Exome последовательности (Уэс) и целом-геном последовательности (РГ)) существенно сократить затраты и время, необходимое для последовательности всей человеческой exome или генома. Тем не менее интерпретация данных Уэс и WGS остается сложной задачей в большинстве случаев, поскольку для каждого пациента десятков до сотен (или даже тысяч, в зависимости от типа анализа) варианты выйти из фильтрации данных.
Чтобы ускорить процесс идентификации Роман MCD причинных генов, Роман систематической стратегии, сочетающей массив CGH, был разработан Уэс и в утробе матери электропорации (МСЭ) отбора кандидата генов. МСЭ позволяет выборочно отключить (или overexpress) специфических генов мутации в грызунов мозги, быстрой оценки их участия в corticogenesis18,19. Ожидается, что при посредничестве RNAi-нокдаун или гиперэкспрессия генов одного или более кандидата вызвать, когда ген связан с развития болезни, локализованные дефекты нейронной миграции и/или созревания. После определения гена, чьи инактивация (или гиперэкспрессия) воспроизводит фенотип, наблюдается у больных грызунов она становится выдающийся кандидатом для скрининга в спорадических больных с MCD. Используя этот подход, мы недавно выявили решающий вклад гена C6orf70 (также известный как ERMARD) в патогенезе НПГ в укрывательстве 6q27 хромосомных удаления16пациентов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Морс являются важными причинами умственной инвалидности и составляют 20-40% лекарственно-детства эпилепсии1,2. Интерес к MCDs резко возросло за последнее десятилетие в результате два основных фактора. Во-первых, улучшение в мозга, томография (особенно МРТ), ко…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим д-р G. Макгилливрей, Pr. Клейтон-Смит, Pr. ВБ Dobyns, Pr. P. Стриано, Pr. т.е. Шеффер, Pr. с.п. Roberston и Pr. с.ф. Berkovic для предоставления MCD пациентов. Мы благодарим д-р F. Мишель и D. Мэй за технические консультации и помощь. Эта работа была поддержана финансирование от 7 Рамочной программы ЕС, желание проекта, номер договора: здоровье-F2-602531-2013, (чтобы V.C., р.г., а.р., а.ф. и C.C.), INSERM (чтобы а.р. и C.C.), Фонд Жером Лежен (R13083AA А.Ф, E.P.P и C.C) и Округов Провинция Альпы Лазурный (APO2014 – ДЕМОТИЧЕСКИЙ C.C. и A.A.D). D.A.K является молодой следователя ЭМБО и поддерживается FWF грантов (I914 и P24367).
Materials
| Picospritzer III | Parker Hannifin Corp | P/N 051-0500-900 | Intracellular Microinjection Dispense Systems |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | Fast green allow visual monitoring of the injection |
| BTX ECM 830 electroporator | BTX Harvard Apparatus | 45-0002 | The ECM 830 is a Square Wave Pulse generator designed for in vitro and in vivo applications |
| Microtome HM 650 V | Microm | 10076838 | Microtome HM 650 V vibratome 240V 50/60Hz with vibrating blade |
| FluoView 300 | Olympus | The Olympus FluoViewTM 300 is a point-scanning, point-detection, confocal laser scanning microscope designed for biology research application | |
| eCELLence software | Glance Vision Technologies | eCELLence is software designed for the quantitive analysis of cell migration | |
| Agilent Microarray Scanner Bundle | Array slides | ||
| for 1 x 244K, 2 x 105K, 4 x 44K or 8 x 15K | Agilent | Agilent p/n G4900DA, G2565CA or G2565BA | |
| for 1 x 1M, 2 x 400K, 4 x 180K or 8 x 60K | Agilent | Agilent p/n G4900DA or G2565CA | |
| Hybridization Chamber, stainless | Agilent | Agilent p/n G2534A | Chamber for array CGH hybridization |
| Hybridization Chamber gasket slides, 5-pack | Gasket for array CGH hybridization | ||
| for 1-pack microarrays or | Agilent | Agilent p/n G2534-60003 | |
| for 2-pack microarrays or | Agilent | Agilent p/n G2534-60002 | |
| for 4-pack microarrays or | Agilent | Agilent p/n G2534-60011 | |
| for 8-pack microarrays | Agilent | Agilent p/n G2534-60014 | |
| Hybridization oven | Agilent | Agilent p/n G2545A | |
| Hybridization oven rotator for Agilent Microarray Hybridization Chambers | Agilent | Agilent p/n G2530-60029 | |
| Thermal cycler with heated lid | Agilent | Agilent p/n G8800A or equivalent | Termal cycler for incubations |
| 1.5 mL RNase-free Microfuge Tube | Ambion | p/n AM12400 or equivalent | Microcentrifuge |
| Magnetic stir bar | Corning | p/n 401435 or equivalent | Instrument for stirring |
| Qubit Fluorometer | Life Technologies | p/n Q32857 | Instrument for DNA quantification |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit, for use with the Qubit fluorometer | Invitrogen | p/n Q32850 | Kit for Qubit fluorometer |
| UV-VIS spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 8000 or 2000, or equivalent | Instrument for DNA quantification |
| P10, P20, P200 and P1000 pipettes | Pipetman or equivalent | DNA dispensation | |
| Vacuum Concentrator | Thermo Scientific | p/n DNA120-115 or equivalent |
Instrument to concentrate DNA |
| SureTag Complete DNA Labeling Kit | Agilent | p/n 5190-4240 | DNA Labeling Kit (for Human Samples) |
| Purification Columns (50 units) | Agilent | p/n 5190-3391 | DNA Labeling Kit (for Human Samples) |
| AutoScreen A, 96-well plates | GE Healthcare | p/n 25-9005-98 | DNA Labeling Kit (for Human Samples) |
| GenElute PCR Clean-Up Kit | Sigma-Aldrich | p/n NA1020 | DNA Labeling Kit (for Human Samples) |
| Human Genomic DNA | p/n G1521 | DNA Labeling Kit (for Human Samples) | |
| For CGH microarrays: | Promega | (female) or p/n G1471 (male) | Array CGH control DNA |
| For CGH+SNP microarrays: | Coriell | p/n NA18507, NA18517, NA12891, NA12878, or NA18579 | Array CGH control DNA |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer Kit or | Agilent | p/n 5188-5226 | Array CGH hybridization and wash |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1 and | Agilent | p/n 5188-5221 | Array CGH hybridization and wash |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 2 | Agilent | p/n 5188-5222 | Array CGH hybridization and wash |
| Stabilization and Drying Solution | Agilent | p/n 5185-5979 | Array CGH hybridization and wash |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit | Agilent | p/n 5188-5220 (25) or p/n 5188-5380 (100) | Array CGH hybridization and wash |
| Human Cot-1 DNA | Agilent | p/n 5190-3393 | Array CGH hybridization and wash |
| Agilent C scanner | Agilent | Scanner for array CGH slides | |
| SureSelect XT2 Reagent Kit | Kit for target enrichment | ||
| HiSeq platform (HSQ), 16 Samples | Agilent | p/n G9621A | |
| HiSeq platform (HSQ), 96 Samples | Agilent | p/n G9621B | |
| HiSeq platform (HSQ), 480 Samples | Agilent | p/n G9621C | |
| MiSeq platform (MSQ), 16 Samples | Agilent | p/n G9622A | |
| MiSeq platform (MSQ), 96 Samples | Agilent | p/n G9622B | |
| MiSeq platform (MSQ), 480 Samples | Agilent | p/n G9622C | |
| DNA 1000 Kit | Agilent | p/n 5067-1504 | Kit for the separation, sizing and quantification of dsDNA fragments from 25 to 1000 bp. |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent | p/n 5067-4626 | Kit for analysis of fragmented DNA or DNA libraries. |
| AMPure XP Kit | Kit for automated PCR purification. | ||
| 5 mL | Agencourt | p/n A63880 | |
| 60 mL | Agencourt | p/n A63881 | |
| 450 mL | Agencourt | p/n A63882 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Isolation and handling of biotinylated nucleic acids | ||
| 2 mL | Life Technologies | Cat #65601 | |
| 10 mL | Life Technologies | Cat #65602 | |
| Quant-iT dsDNA BR Assay Kit, for the Qubit fluorometer | DNA quantification | ||
| 100 assays, 2-1000 ng | Life Technologies | Cat #Q32850 | |
| 500 assays, 2-1000 ng | Life Technologies | Cat #Q32853 | |
| Qubit assay tubes | Life Technologies | p/n Q32856 | DNA quantification |
| SureSelec tXT2 Capture Libraries | Agilent | depending on the experiment | Kit for libraries capture |
| SureCycler 8800 Thermal Cycler | Agilent | p/n G8800A | DNA amplification |
| 96 well plate module for SureCycler 8800 Thermal Cycler | Agilent | p/n G8810A | DNA amplification |
| SureCycler 8800-compatible 96-well plates | Agilent | p/n 410088 | DNA amplification |
| Optical strip caps | Agilent | p/n 401425 | DNA amplification |
| Tube cap strips, domed | Agilent | p/n 410096 | DNA amplification |
| Compression mats | Agilent | p/n 410187 | DNA amplification |
| 2100 Bioanalyzer Laptop Bundle | Agilent | p/n G2943CA | DNA amplification |
| 2100 Bioanalyzer Electrophoresis Set | Agilent | p/n G2947CA | DNA amplification |
| Covaris Sample Preparation System, E-series or S-series | Covaris | DNA shearing | |
| Covaris sample holders | p/n 520078 | DNA shearing | |
| Nutator plate mixer | BD Diagnostics | p/n 421105 or equivalent | Plate Mixer |
| GaIIx | Illumina | next generation sequencing machine |
Riferimenti
- Meencke, H. J., Veith, G. Migration disturbances in epilepsy. Epilepsy Res. 9, 31-39 (1992).
- Shorvon, S., Stefan, H. Overview of the safety of newer antiepileptic drugs. Epilepsia. 38 (1), 45-51 (1997).
- Parrini, E., et al. Periventricular heterotopia: phenotypic heterogeneity and correlation with Filamin A mutations. Brain. 129 (7), 1892-1906 (2006).
- Fox, J. W., et al. Mutations in filamin 1 prevent migration of cerebral cortical neurons in human periventricular heterotopia. Neuron. 21 (6), 1315-1325 (1998).
- Sheen, V. L., et al. Mutations in ARFGEF2 implicate vesicle trafficking in neural progenitor proliferation and migration in the human cerebral cortex. Nat Genet. 36 (1), 69-76 (2004).
- Cappello, S., et al. Mutations in genes encoding the cadherin receptor-ligand pair DCHS1 and FAT4 disrupt cerebral cortical development. Nat Genet. 45 (11), 1300-1308 (2013).
- Moro, F., et al. Periventricular heterotopia in fragile X syndrome. Neurology. 67 (4), 713-715 (2006).
- Ferland, R. J., Gaitanis, J. N., Apse, K., Tantravahi, U., Walsh, C. A., Sheen, V. L. Periventricular nodular heterotopia and Williams syndrome. Am J Med Genet A. 140 (12), 1305-1311 (2006).
- van Kogelenberg, M., et al. Periventricular heterotopia in common microdeletion syndromes. Mol Syndromol. 1 (1), 35-41 (2010).
- Sheen, V. L., et al. Periventricular heterotopia associated with chromosome 5p anomalies. Neurology. 60 (6), 1033-1036 (2003).
- Neal, J., Apse, K., Sahin, M., Walsh, C. A., Sheen, V. L. Deletion of chromosome 1p36 is associated with periventricular nodular heterotopia. Am J Med Genet A. 140 (15), 1692-1695 (2006).
- Cardoso, C., et al. Periventricular heterotopia, mental retardation, and epilepsy associated with 5q14.3-q15 deletion. Neurology. 72 (9), 784-792 (2009).
- Cellini, E., et al. Periventricular heterotopia with white matter abnormalities associated with 6p25 deletion. Am J Med Genet A. 158 (7), 1793-1797 (2006).
- Bertini, V., De Vito, G., Costa, R., Simi, P., Valetto, A. Isolated 6q terminal deletions: an emerging new syndrome. Am J Med Genet A. 140 (1), 74-81 (2006).
- Dobyns, W. B., et al. Consistent chromosome abnormalities identify novel polymicrogyria loci in 1p36.3, 2p16.1-p23.1, 4q21.21-q22.1, 6q26-q27, and 21q2. Am J Med Genet A. 146 (13), 1637-1654 (2008).
- Conti, V., et al. Periventricular heterotopia in 6q terminal deletion syndrome: role of the C6orf70 gene. Brain. 136 (11), 3378-3394 (2013).
- Sheen, V. L., et al. Etiological heterogeneity of familial periventricular heterotopia and hydrocephalus. Brain Dev. 26 (5), 326-334 (2004).
- Jaglin, X. H., et al. Mutations in the beta-tubulin gene TUBB2B result in asymmetrical polymicrogyria. Nat. Genet. 41 (6), 746-752 (2009).
- Falace, A., et al. TBC1D24 regulates neuronal migration and maturation through modulation of the ARF6-dependent pathway. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (6), 2337-2342 (2014).
- Lunter, G., Goodson, M. Stampy: a statistical algorithm for sensitive and fast mapping of Illumina sequence reads. Genome Res. 21 (6), 936-939 (2011).
- Pagnamenta, A. T., et al. Exome sequencing can detect pathogenic mosaic mutations present at low allele frequencies. J Hum Genet. 57 (1), 70-72 (2012).
- Yu, J. Y., DeRuiter, S. L., Turner, D. L. RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (9), 6047-6052 (2002).
- Bai, J., et al. RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex. Nat Neurosci. 6 (12), 1277-1283 (2003).
- Carabalona, A., et al. A glial origin for periventricular nodular heterotopia caused by impaired expression of Filamin-A. Hum Mol Genet. 21 (5), 1004-1017 (2012).
