إليسا القائم وتجليد وأسلوب المنافسة لتحديد بسرعة التفاعلات يجند مستقبلات
Summary
The presented protocols describe two enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) based techniques for the rapid investigation of ligand-receptor interactions: The first assay allows the determination of dissociation constant between ligand and receptor. The second assay enables a rapid screening of blocking peptides for ligand-receptor interactions.
Abstract
A comprehensive understanding of signaling pathways requires detailed knowledge regarding ligand-receptor interaction. This article describes two fast and reliable point-by-point protocols of enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) for the investigation of ligand-receptor interactions: the direct ligand-receptor interaction assay (LRA) and the competition LRA. As a case study, the ELISA based analysis of the interaction between different lambda interferons (IFNLs) and the alpha subunit of their receptor (IL28RA) is presented: the direct LRA is used for the determination of dissociation constants (KD values) between receptor and IFN ligands, and the competition LRA for the determination of the inhibitory capacity of an oligopeptide, which was designed to compete with the IFNLs at their receptor binding site. Analytical steps to estimate KD and half maximal inhibitory concentration (IC50) values are described. Finally, the discussion highlights advantages and disadvantages of the presented method and how the results enable a better molecular understanding of ligand-receptor interactions.
Introduction
فهم شامل للمسارات إشارات يتطلب معرفة تفصيلية عن التفاعل يجند مستقبلات. معظم وسائل لتقييم تفاعل يجند خاص مع مستقبلات معينة لها مكلفة ومستهلكة للوقت والعمل مكثفة وتتطلب معدات وخبرات 1 محددة.
توضح هذه المقالة بروتوكولين سريعة وموثوق بها نقطة بنقطة للتحقيق التفاعل يجند مستقبلات بناء على انزيم مرتبط المناعي فحص (ELISA): ومباشر يجند مستقبلات التفاعل فحص (جيش الرب للمقاومة) وجيش الرب للمقاومة المنافسة. إليسا هي تقنية حساسة للغاية ومحددة ومتاحة بسهولة، وتستخدم بشكل روتيني في مختبر تقريبا. إليسا لا يمكن أن يؤديها وتكييفها في الموضات المختلفة. يتم تحسين البروتوكولات المعروضة للتحقيق التفاعل بين إنترفيرون مختلفة امدا (INFLs) ومستقبلات بهم.
جيش الرب للمقاومة المباشر يسمح لquantificatiعلى من يجند مستقبلات ملزمة فيما يتعلق تركيز يجند وبالتالي ينتج منحنى ملزم. باستخدام نموذج مناسب للتفاعل يجند مستقبلات، البيانات يمكن تحليلها لتقدير ثابت التفكك (K D).
في بروتوكول المعروضة، يتم تطبيق هيل المعادلة التي يشيع استخدامها في تصميم نموذج ليجند مستقبلات ملزمة. رغم أن هناك طرقا أخرى مثل تكنولوجيا الرنين مأكل سطح 2،3 تسمح تحديد الانتماءات الملزمة بين اثنين من البروتينات، وهذه التكنولوجيا هي في كثير من الأحيان كثيفة العمالة، ومكلفة، وتتطلب معدات المختبرات الخاصة.
جيش الرب للمقاومة المنافسة يمكن فحص الببتيد المثبطة: كميا ويجند مستقبلات ملزم فيما يتعلق تركيز الببتيد. هذا ينتج منحنى الاستجابة للجرعة واصفا تأثير كابح من الببتيد. البيانات يمكن تحليلها لتقدير نصف تركيز مثبط القصوى (IC 50 </فرعية>) من الببتيد حظر.
كلا البروتوكولين إليسا هي سهلة الاستخدام، ويمكن أن تتكيف مع مجموعة واسعة من الأسئلة البحثية. البروتينات المؤتلف من أي نوع يمكن استخدامها لتحديد موثوق وسريع الأجزاء التفاعل. وبالإضافة إلى ذلك، جيش الرب للمقاومة المنافسة يمكن استخدامها لتحديد مواقع التفاعل تنتقد بروابط ومستقبلات باستخدام منع الببتيدات، والتي صممت لتحاكي إما يجند أو مستقبلات. إذا أظهر الببتيد عرقلة وتثبيط فعالية ومحددة، الببتيد يحتل موقعا حاسما تفاعل يجند (إذا كان يقلد الببتيد مستقبلات) أو من يجند (إذا كان يقلد الببتيد يجند).
يصف البروتوكول الأول تحديد K D قيمة INFLs مختلفة والوحيدات ألفا من المستقبلات الخاصة بهم، أي مستقبلات انترلوكين 28 (IL28RA) باستخدام جيش الرب للمقاومة المباشر. بعد ذلك، يوضح البروتوكول الثاني كيفية تحديد قدرة الببتيد 20 الأحماض الأمينية طويلا لتمنع التفاعلات INFL-IL28RA. تم تصميم الببتيد للتنافس مع IFNLs في موقع مستقبلات تجليدها وبالتالي يمكن فهم الجزيئي للتفاعل. وعلاوة على ذلك، وهذا الببتيد يمكن استخدامها لمنع IL28RA في تجارب في المختبر لتحديد تأثير ذلك على آثار يشير المصب 4.
Protocol
Representative Results
Discussion
إليسا هو المعيار وطريقة راسخة للعديد من المختبرات. لقد مزيد من التعديل وتحسين طريقة 5،7 المنشورة سابقا. ويبين أثبتت بروتوكول خطوة بخطوة كيف يمكن استخدامها في طريقة بسيطة لتحديد القيم K D التفاعلات يجند مستقبلات. بالإضافة إلى ذلك، IC50 من الببتيد الحجب الذي ي?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Prof. J. Stelling (Department of Biosystems Science and Engineering, ETH Zurich and Swiss Institute for Bioinformatics, Basel, Switzerland) for his critical review of the manuscript.
Materials
| Nunc-Immunoplate (F96 Maxi sorp) | Thermo Scientific | 442404 | ELISA plate |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Merck | 497-19-8 | For ELISA plate coating buffer |
| Sodium hydrogen carbomnate(NaHCO3) | Merck | 144-55-8 | For ELISA plate coating buffer |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030-100G | 5% BSA in PBS for Blocking |
| rhIL-28Rα/IFNλR1 | R&D systems | 5260-MR | Recombinant human interlukin-28 Receptor alpha |
| rhIL-29/IFNλ1 | R&D systems | 1598-IL/CF | Recombinant human interlukin-29/Carrier free/C-terminal 10-His tag |
| rhIL-28A/IFNλ2 | R&D systems | 1587-IL/CF | Recombinant human interlukin-28A/Carrier free/C-terminal 6-His tag |
| rhIL-28B/IFNλ3 | R&D systems | 5259-IL/CF | Recombinant human interlukin-28B/Carrier free/C-terminal 6-His tag |
| 6X His Monoclonal antibody (Mouse) | Clontech | 631212 | Primary antiboy to capture His tagged Ligands |
| Goat anti-Mouse igG (H+L) | Jackson Immuno Research | 115-035-166 | Horseradish Peroxidase conjucated secondary antibody |
| BDoptEIA TMB reagent set | BD Biosciences | 555214 | ELISA – TMB substrate solution |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Fulka | 84720 | 5N H2SO4 (Enzyme reaction stop solution) |
| Synergy/H1 – Microplate reader | BioTeK | ELISA plate reader |
Riferimenti
- Schneider, P., Willen, L., Smulski, C. R. Tools and techniques to study ligand-receptor interactions and receptor activation by TNF superfamily members. Methods in enzymology. 545, 103-125 (2014).
- Rossi, G., et al. Biosensor analysis of anti-citrullinated protein/peptide antibody affinity. Analytical biochemistry. 465, 96-101 (2014).
- van der Merwe, P. A., Barclay, A. N. Analysis of cell-adhesion molecule interactions using surface plasmon resonance. Curr Opin Immunol. 8, 257-261 (1996).
- Egli, A., et al. IL-28B is a key regulator of B- and T-cell vaccine responses against influenza. PLoS Pathog. 10, e1004556 (2014).
- Rosenbluh, J., et al. Positively charged peptides can interact with each other, as revealed by solid phase binding assays. Analytical biochemistry. 352, 157-168 (2006).
- Goutelle, S., et al. The Hill equation: a review of its capabilities in pharmacological modelling. Fundamental & clinical pharmacology. 22, 633-648 (2008).
- Levin, A., et al. Peptides derived from HIV-1 integrase that bind Rev stimulate viral genome integration. PLoS One. 4, e4155 (2009).
- Egli, A., Santer, M. D., O’Shea, D., Tyrrell, D. L., Houghton, M. The impact of the interferon-lambda family on the innate and adaptive immune response to viral infections. Emerging infectious diseases. , e51 (2014).
- Gad, H. H., Hamming, O. J., Hartmann, R. The structure of human interferon lambda and what it has taught us. J Interferon Cytokine Res. 30, 565-571 (2010).
- Folch, B., Rooman, M., Dehouck, Y. Thermostability of salt bridges versus hydrophobic interactions in proteins probed by statistical potentials. Journal of chemical information and modeling. 48, 119-127 (2008).
- Yuzlenko, O., Lazaridis, T. Interactions between ionizable amino acid side chains at a lipid bilayer-water interface. The journal of physical chemistry. B. 115, 13674-13684 (2011).
- Tissot, A. C., Vuilleumier, S., Fersht, A. R. Importance of two buried salt bridges in the stability and folding pathway of barnase. Biochimica. 35, 6786-6794 (1996).
