एक एलिसा के आधार बंधन और प्रतियोगिता विधि तेजी से ligand-रिसेप्टर बातचीत निर्धारित करने के लिए
Summary
The presented protocols describe two enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) based techniques for the rapid investigation of ligand-receptor interactions: The first assay allows the determination of dissociation constant between ligand and receptor. The second assay enables a rapid screening of blocking peptides for ligand-receptor interactions.
Abstract
A comprehensive understanding of signaling pathways requires detailed knowledge regarding ligand-receptor interaction. This article describes two fast and reliable point-by-point protocols of enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) for the investigation of ligand-receptor interactions: the direct ligand-receptor interaction assay (LRA) and the competition LRA. As a case study, the ELISA based analysis of the interaction between different lambda interferons (IFNLs) and the alpha subunit of their receptor (IL28RA) is presented: the direct LRA is used for the determination of dissociation constants (KD values) between receptor and IFN ligands, and the competition LRA for the determination of the inhibitory capacity of an oligopeptide, which was designed to compete with the IFNLs at their receptor binding site. Analytical steps to estimate KD and half maximal inhibitory concentration (IC50) values are described. Finally, the discussion highlights advantages and disadvantages of the presented method and how the results enable a better molecular understanding of ligand-receptor interactions.
Introduction
संकेत दे रास्ते की एक व्यापक समझ ligand रिसेप्टर बातचीत के बारे में विस्तृत ज्ञान की आवश्यकता है। अपनी विशिष्ट रिसेप्टर के साथ एक विशेष ligand की बातचीत का आकलन करने के लिए सबसे तरीकों महंगे हैं, समय लेने वाली है, श्रम गहन और विशिष्ट उपकरण और विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है 1।
यह लेख दो तेज और विश्वसनीय बिंदु से बिंदु प्रोटोकॉल का वर्णन ligand रिसेप्टर एक एंजाइम के आधार पर जांच करने के लिए बातचीत immunosorbent परख (एलिसा) से जुड़ा हुआ: प्रत्यक्ष ligand रिसेप्टर बातचीत परख (एलआरए) और प्रतियोगिता एलआरए। एलिसा एक बेहद संवेदनशील, विशिष्ट और आसानी से उपलब्ध तकनीक, नियमित तौर पर लगभग हर प्रयोगशाला में प्रयोग किया जाता है। एलिसा प्रदर्शन किया और विभिन्न फैशन में रूपांतरित किया जा सकता है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल अलग लैम्ब्डा इंटरफेरॉन (INFLs) और उनके रिसेप्टर के बीच बातचीत की जांच के लिए अनुकूलित कर रहे हैं।
प्रत्यक्ष एलआरए एक quantificati के लिए अनुमति देता हैligand रिसेप्टर की एकाग्रता पर ligand के संबंध में बाध्यकारी है और इस तरह एक बाध्यकारी वक्र पैदावार। Ligand रिसेप्टर बातचीत के लिए एक उपयुक्त मॉडल का उपयोग करना, डेटा आगे हदबंदी निरंतर (कश्मीर डी) अनुमान लगाने के लिए विश्लेषण किया जा सकता है।
प्रस्तुत प्रोटोकॉल में, आमतौर पर इस्तेमाल हिल समीकरण ligand-रिसेप्टर बंधन मॉडल करने के लिए लागू किया जाता है। हालांकि इस तरह की सतह plasmon अनुनाद प्रौद्योगिकी 2,3 के रूप में अन्य तरीकों दो प्रोटीन के बीच बाध्यकारी समानताएं के निर्धारण के लिए अनुमति देते हैं, इस तकनीक अक्सर श्रम गहन, महंगा है, और विशेष प्रयोगशाला उपकरणों की आवश्यकता है।
प्रतियोगिता एलआरए निरोधात्मक पेप्टाइड्स की स्क्रीनिंग के लिए सक्षम बनाता है: ligand रिसेप्टर बाध्यकारी पेप्टाइड एकाग्रता के संबंध में मात्रा निर्धारित है। यह एक खुराक प्रतिक्रिया वक्र पेप्टाइड की निरोधात्मक प्रभाव का वर्णन अर्जित करता है। डेटा आगे (आईसी 50 आधा अधिक से अधिक निरोधात्मक एकाग्रता अनुमान लगाने के लिए विश्लेषण किया जा सकता </उप> अवरुद्ध पेप्टाइड)।
दोनों एलिसा प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए आसान कर रहे हैं और अनुसंधान के सवालों की एक व्यापक श्रृंखला के लिए अनुकूलित किया जा सकता। किसी भी प्रकार की पुनः संयोजक प्रोटीन मज़बूती से और तेजी से बातचीत भागों का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अलावा, प्रतियोगिता एलआरए अवरुद्ध पेप्टाइड, जो या तो ligand या रिसेप्टर नकल करने के लिए तैयार कर रहे हैं का उपयोग करके ligands और रिसेप्टर्स की महत्वपूर्ण बातचीत साइटों का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। अवरुद्ध पेप्टाइड कुशल और विशिष्ट निषेध पता चलता है, पेप्टाइड ligand के एक महत्वपूर्ण बातचीत साइट (यदि पेप्टाइड mimics रिसेप्टर) या ligand के (यदि पेप्टाइड mimics ligand) रह रहे हैं।
पहले प्रोटोकॉल अलग INFLs की कश्मीर घ मूल्य निर्धारण और उनकी रिसेप्टर के अल्फा सबयूनिट, यानी वर्णन है, इंटरल्यूकिन 28 रिसेप्टर (IL28RA) डायरेक्ट एलआरए का उपयोग कर। इसके बाद, दूसरे प्रोटोकॉल दिखाता है कि कैसे करने के लिए एक 20 एमिनो एसिड लंबे पेप्टाइड की क्षमता निर्धारित करने के लिएInfl-IL28RA बातचीत को रोकती हैं। पेप्टाइड उनकी रिसेप्टर बाध्यकारी साइट पर IFNLs के साथ प्रतिस्पर्धा करने के लिए बनाया गया है और इस तरह की बातचीत का एक आणविक समझ में सक्षम बनाता है। इसके अलावा, इस पेप्टाइड इन विट्रो प्रयोगों में IL28RA ब्लॉक करने के लिए नीचे की ओर संकेत प्रभाव 4 पर प्रभाव को निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
एलिसा एक मानक और कई प्रयोगशालाओं के लिए अच्छी तरह से स्थापित विधि है। हम आगे संशोधित और एक पहले प्रकाशित विधि 5.7 सुधार हुआ है। प्रदर्शन कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल से पता चलता है कि यह कैसे ligand रिसेप्टर बातच…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Prof. J. Stelling (Department of Biosystems Science and Engineering, ETH Zurich and Swiss Institute for Bioinformatics, Basel, Switzerland) for his critical review of the manuscript.
Materials
| Nunc-Immunoplate (F96 Maxi sorp) | Thermo Scientific | 442404 | ELISA plate |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Merck | 497-19-8 | For ELISA plate coating buffer |
| Sodium hydrogen carbomnate(NaHCO3) | Merck | 144-55-8 | For ELISA plate coating buffer |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030-100G | 5% BSA in PBS for Blocking |
| rhIL-28Rα/IFNλR1 | R&D systems | 5260-MR | Recombinant human interlukin-28 Receptor alpha |
| rhIL-29/IFNλ1 | R&D systems | 1598-IL/CF | Recombinant human interlukin-29/Carrier free/C-terminal 10-His tag |
| rhIL-28A/IFNλ2 | R&D systems | 1587-IL/CF | Recombinant human interlukin-28A/Carrier free/C-terminal 6-His tag |
| rhIL-28B/IFNλ3 | R&D systems | 5259-IL/CF | Recombinant human interlukin-28B/Carrier free/C-terminal 6-His tag |
| 6X His Monoclonal antibody (Mouse) | Clontech | 631212 | Primary antiboy to capture His tagged Ligands |
| Goat anti-Mouse igG (H+L) | Jackson Immuno Research | 115-035-166 | Horseradish Peroxidase conjucated secondary antibody |
| BDoptEIA TMB reagent set | BD Biosciences | 555214 | ELISA – TMB substrate solution |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Fulka | 84720 | 5N H2SO4 (Enzyme reaction stop solution) |
| Synergy/H1 – Microplate reader | BioTeK | ELISA plate reader |
Riferimenti
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