Un ELISA Based rilegatura e metodo concorrenza di determinare con rapidità interazioni ligando-recettore
Summary
The presented protocols describe two enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) based techniques for the rapid investigation of ligand-receptor interactions: The first assay allows the determination of dissociation constant between ligand and receptor. The second assay enables a rapid screening of blocking peptides for ligand-receptor interactions.
Abstract
A comprehensive understanding of signaling pathways requires detailed knowledge regarding ligand-receptor interaction. This article describes two fast and reliable point-by-point protocols of enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) for the investigation of ligand-receptor interactions: the direct ligand-receptor interaction assay (LRA) and the competition LRA. As a case study, the ELISA based analysis of the interaction between different lambda interferons (IFNLs) and the alpha subunit of their receptor (IL28RA) is presented: the direct LRA is used for the determination of dissociation constants (KD values) between receptor and IFN ligands, and the competition LRA for the determination of the inhibitory capacity of an oligopeptide, which was designed to compete with the IFNLs at their receptor binding site. Analytical steps to estimate KD and half maximal inhibitory concentration (IC50) values are described. Finally, the discussion highlights advantages and disadvantages of the presented method and how the results enable a better molecular understanding of ligand-receptor interactions.
Introduction
Una comprensione completa delle vie di segnalazione richiede una conoscenza dettagliata circa l'interazione ligando-recettore. La maggior parte dei metodi per valutare l'interazione di un particolare ligando con il recettore specifico sono costosi, in termini di tempo, manodopera e richiedono attrezzature e competenze specifiche 1.
Questo articolo descrive due protocolli veloce e affidabile punto per punto per studiare l'interazione ligando-recettore sulla base di un enzima collegato immunosorbent assay (ELISA): il saggio di interazione ligando-recettore diretta (LRA) e l'LRA concorrenza. ELISA è una tecnica molto sensibile, specifico e facilmente disponibile, solitamente usata in quasi ogni laboratorio. ELISA può essere eseguito e adattato in varie mode. I protocolli presentati sono ottimizzati per la ricerca delle interazioni tra i diversi interferoni lambda (INFLs) e la loro recettore.
L'LRA diretta consente una quantificatisu ligando-recettore vincolante rispetto alla concentrazione del ligando e produce pertanto una curva vincolante. Usando un modello appropriato per l'interazione ligando-recettore, i dati possono essere ulteriormente analizzati per stimare la costante di dissociazione (K D).
Nel protocollo presentato, l'equazione Hill comunemente usato è applicata per modellare il legame ligando-recettore. Sebbene altri metodi come la superficie plasmon risonanza a 2,3 consentono la determinazione delle affinità di legame tra due proteine, questa tecnologia è spesso laborioso, costoso e richiede attrezzature speciali di laboratorio.
L'LRA concorrenza consente la proiezione di peptidi inibitori: il legame ligando-recettore viene quantificata rispetto alla concentrazione di peptide. Questo produce una curva dose-risposta che descrive l'effetto inibitorio del peptide. I dati possono essere ulteriormente analizzati per stimare la metà massima concentrazione inibitoria (IC 50 </sub>) del peptide bloccante.
Entrambi protocolli ELISA sono facili da usare e possono essere adattati ad una vasta gamma di domande di ricerca. proteine ricombinanti di qualsiasi tipo possono essere utilizzati per determinare in modo affidabile e veloce le parti di interazione. Inoltre, l'Lra concorrenza può essere utilizzato per determinare siti di interazione critici di ligandi e recettori utilizzando peptidi di blocco, che sono progettati per imitare sia il ligando o il recettore. Se il peptide bloccante mostra l'inibizione efficace e specifico, il peptide occupa un sito critico interazione del ligando (se imita peptidici del recettore) o del ligando (se imita peptide ligando).
Il primo protocollo descrive la determinazione K D valore delle diverse INFLs e la subunità alfa del loro recettore, cioè il recettore dell'interleuchina-28 (IL28RA) usando l'LRA diretta. Successivamente, il secondo protocollo mostra come determinare la capacità di un lungo peptide di 20 aminoacidi diinibire le interazioni INFL-IL28RA. Il peptide è stato progettato per competere con IFNLs al loro recettore sito di legame e consente così una comprensione molecolare dell'interazione. Inoltre, questo peptide può essere utilizzato per bloccare IL28RA in esperimenti in vitro per determinare l'impatto sugli effetti di segnalazione a valle 4.
Protocol
Representative Results
Discussion
ELISA è uno standard e il metodo consolidato per molti laboratori. Abbiamo ulteriormente modificato e migliorato un metodo 5,7 precedentemente pubblicato. Il protocollo passo-passo dimostrato mostra come può essere utilizzato in modo semplice per determinare i valori K D di interazioni ligando-recettore. Inoltre, la IC50 di un peptide bloccante che interferisce con l'interazione ligando-recettore può essere determinato.
I principali vantaggi sono la rapida messa …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Prof. J. Stelling (Department of Biosystems Science and Engineering, ETH Zurich and Swiss Institute for Bioinformatics, Basel, Switzerland) for his critical review of the manuscript.
Materials
| Nunc-Immunoplate (F96 Maxi sorp) | Thermo Scientific | 442404 | ELISA plate |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Merck | 497-19-8 | For ELISA plate coating buffer |
| Sodium hydrogen carbomnate(NaHCO3) | Merck | 144-55-8 | For ELISA plate coating buffer |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030-100G | 5% BSA in PBS for Blocking |
| rhIL-28Rα/IFNλR1 | R&D systems | 5260-MR | Recombinant human interlukin-28 Receptor alpha |
| rhIL-29/IFNλ1 | R&D systems | 1598-IL/CF | Recombinant human interlukin-29/Carrier free/C-terminal 10-His tag |
| rhIL-28A/IFNλ2 | R&D systems | 1587-IL/CF | Recombinant human interlukin-28A/Carrier free/C-terminal 6-His tag |
| rhIL-28B/IFNλ3 | R&D systems | 5259-IL/CF | Recombinant human interlukin-28B/Carrier free/C-terminal 6-His tag |
| 6X His Monoclonal antibody (Mouse) | Clontech | 631212 | Primary antiboy to capture His tagged Ligands |
| Goat anti-Mouse igG (H+L) | Jackson Immuno Research | 115-035-166 | Horseradish Peroxidase conjucated secondary antibody |
| BDoptEIA TMB reagent set | BD Biosciences | 555214 | ELISA – TMB substrate solution |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Fulka | 84720 | 5N H2SO4 (Enzyme reaction stop solution) |
| Synergy/H1 – Microplate reader | BioTeK | ELISA plate reader |
Riferimenti
- Schneider, P., Willen, L., Smulski, C. R. Tools and techniques to study ligand-receptor interactions and receptor activation by TNF superfamily members. Methods in enzymology. 545, 103-125 (2014).
- Rossi, G., et al. Biosensor analysis of anti-citrullinated protein/peptide antibody affinity. Analytical biochemistry. 465, 96-101 (2014).
- van der Merwe, P. A., Barclay, A. N. Analysis of cell-adhesion molecule interactions using surface plasmon resonance. Curr Opin Immunol. 8, 257-261 (1996).
- Egli, A., et al. IL-28B is a key regulator of B- and T-cell vaccine responses against influenza. PLoS Pathog. 10, e1004556 (2014).
- Rosenbluh, J., et al. Positively charged peptides can interact with each other, as revealed by solid phase binding assays. Analytical biochemistry. 352, 157-168 (2006).
- Goutelle, S., et al. The Hill equation: a review of its capabilities in pharmacological modelling. Fundamental & clinical pharmacology. 22, 633-648 (2008).
- Levin, A., et al. Peptides derived from HIV-1 integrase that bind Rev stimulate viral genome integration. PLoS One. 4, e4155 (2009).
- Egli, A., Santer, M. D., O’Shea, D., Tyrrell, D. L., Houghton, M. The impact of the interferon-lambda family on the innate and adaptive immune response to viral infections. Emerging infectious diseases. , e51 (2014).
- Gad, H. H., Hamming, O. J., Hartmann, R. The structure of human interferon lambda and what it has taught us. J Interferon Cytokine Res. 30, 565-571 (2010).
- Folch, B., Rooman, M., Dehouck, Y. Thermostability of salt bridges versus hydrophobic interactions in proteins probed by statistical potentials. Journal of chemical information and modeling. 48, 119-127 (2008).
- Yuzlenko, O., Lazaridis, T. Interactions between ionizable amino acid side chains at a lipid bilayer-water interface. The journal of physical chemistry. B. 115, 13674-13684 (2011).
- Tissot, A. C., Vuilleumier, S., Fersht, A. R. Importance of two buried salt bridges in the stability and folding pathway of barnase. Biochimica. 35, 6786-6794 (1996).
