ELISA 기반 바인딩과 경쟁 방법은 신속 리간드 - 수용체 상호 작용을 확인하는 방법
Summary
The presented protocols describe two enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) based techniques for the rapid investigation of ligand-receptor interactions: The first assay allows the determination of dissociation constant between ligand and receptor. The second assay enables a rapid screening of blocking peptides for ligand-receptor interactions.
Abstract
A comprehensive understanding of signaling pathways requires detailed knowledge regarding ligand-receptor interaction. This article describes two fast and reliable point-by-point protocols of enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) for the investigation of ligand-receptor interactions: the direct ligand-receptor interaction assay (LRA) and the competition LRA. As a case study, the ELISA based analysis of the interaction between different lambda interferons (IFNLs) and the alpha subunit of their receptor (IL28RA) is presented: the direct LRA is used for the determination of dissociation constants (KD values) between receptor and IFN ligands, and the competition LRA for the determination of the inhibitory capacity of an oligopeptide, which was designed to compete with the IFNLs at their receptor binding site. Analytical steps to estimate KD and half maximal inhibitory concentration (IC50) values are described. Finally, the discussion highlights advantages and disadvantages of the presented method and how the results enable a better molecular understanding of ligand-receptor interactions.
Introduction
신호 전달 경로의 포괄적 인 이해는 리간드 – 수용체 상호 작용에 대한 자세한 지식이 필요합니다. 그 특정 수용체와 특정 리간드의 상호 작용을 평가하기위한 대부분의 방법은 시간이 많이 걸리고, 노동 집약적, 비싼 특정 장비와 전문 지식 1을 필요로한다.
직접 리간드 – 수용체 상호 작용 분석 (LRA)와 경쟁 LRA :이 문서에서는 면역 분석법 (ELISA)을 연결하는 효소에 따라 리간드 – 수용체 상호 작용을 조사하기 위해 두 빠르고 신뢰할 수있는 포인트 별 프로토콜을 설명합니다. ELISA는 일상적으로 거의 모든 실험에서 사용 된 매우 민감한 특정 용이 가능한 기술이다. ELISA를 수행하고 다양한 패션에 적응 될 수있다. 제시된 프로토콜은 다른 인터페론 람다 (INFLs)와 그 수용체 간의 상호 작용 연구를 위해 최적화된다.
직접 LRA는 quantificati 수 있습니다리간드 – 수용체의 리간드 농도에 대해 결합함으로써 결합 곡선을 산출한다. 리간드 – 수용체 상호 작용에 대한 적절한 모델을 사용하여, 데이터가 상기 해리 상수 (K D)를 추정하기 위해 분석 될 수있다.
제시된 프로토콜, 일반적으로 사용되는 힐 방정식 리간드 결합 수용체를 모델링에 적용된다. 이러한 표면 플라즈몬 공명 기술 2,3- 다른 방법은 두 단백질 사이의 결합 친화도의 측정을 할 수 있지만,이 기술은 종종 노동 집약적 고가이고 특별한 실험 장비를 필요로한다.
LRA는 경쟁 저해 펩티드의 스크리닝을 가능 : 리간드 결합 수용체 펩티드가 농도에 대해 정량화된다. 이것은 펩티드의 억제 효과를 설명하는 용량 – 반응 곡선을 산출한다. 데이터는 상기 IC (50) (반 최대한 억제 농도를 추정하기 위해 분석 될 수있다 </서브>) 블로킹 펩타이드.
두 ELISA 프로토콜은 사용하기 쉽고 연구 질문의 넓은 범위로 적용 할 수있다. 어떤 종류의 재조합 단백질을 확실하고 빠르게 상호 작용 부분을 결정하기 위해 사용될 수있다. 또한, 경쟁 LRA는 리간드 또는 수용체를 모방하도록 설계 차단 펩티드를 사용하여 리간드 및 수용체의 중요한 상호 작용 위치를 결정하는데 사용될 수있다. 차단 펩타이드 효율적이고 특정 억제를 표시하는 경우, 펩타이드는 중요한 상호 작용 리간드의 사이트 (펩타이드 모방 경우 수용체) 또는 리간드 (펩타이드 모방 경우 리간드)를 차지한다.
제 1 프로토콜은 다른 INFLs의 K D 값 결정 및 리셉터의 알파 서브 유니트, 즉 설명 직접 LRA를 사용하여 인터루킨 28 수용체 (IL28RA). 다음에, 제 2 프로토콜에 20 아미노산 길이의 펩티드의 능력을 확인하는 방법을 도시INFL-IL28RA 상호 작용을 억제한다. 펩티드들은 수용체 결합 부위에서 IFNLs 경쟁하도록 설계함으로써 상호 작용 분자 이해할 수있다. 또한,이 펩타이드는 하류 시그널링 4 효과에 미치는 영향을 결정하기 위해 시험 관내 실험에서 IL28RA을 차단하는데 사용될 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
ELISA는 많은 실험실에 대한 표준과 잘 확립 된 방법이다. 우리는 더 수정 이전에 게시 된 방법 5,7를 개선했다. 입증 단계별 프로토콜이 리간드 – 수용체 상호 작용의 K D 값을 결정하는 간단한 방법으로 사용할 수있는 방법을 도시한다. 또한, 리간드 – 수용체 상호 작용을 방해 차단 펩타이드 IC50이 측정 될 수있다.
대부분의 연구자들은 이전 ELISA 프로토콜을 사?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Prof. J. Stelling (Department of Biosystems Science and Engineering, ETH Zurich and Swiss Institute for Bioinformatics, Basel, Switzerland) for his critical review of the manuscript.
Materials
| Nunc-Immunoplate (F96 Maxi sorp) | Thermo Scientific | 442404 | ELISA plate |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Merck | 497-19-8 | For ELISA plate coating buffer |
| Sodium hydrogen carbomnate(NaHCO3) | Merck | 144-55-8 | For ELISA plate coating buffer |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030-100G | 5% BSA in PBS for Blocking |
| rhIL-28Rα/IFNλR1 | R&D systems | 5260-MR | Recombinant human interlukin-28 Receptor alpha |
| rhIL-29/IFNλ1 | R&D systems | 1598-IL/CF | Recombinant human interlukin-29/Carrier free/C-terminal 10-His tag |
| rhIL-28A/IFNλ2 | R&D systems | 1587-IL/CF | Recombinant human interlukin-28A/Carrier free/C-terminal 6-His tag |
| rhIL-28B/IFNλ3 | R&D systems | 5259-IL/CF | Recombinant human interlukin-28B/Carrier free/C-terminal 6-His tag |
| 6X His Monoclonal antibody (Mouse) | Clontech | 631212 | Primary antiboy to capture His tagged Ligands |
| Goat anti-Mouse igG (H+L) | Jackson Immuno Research | 115-035-166 | Horseradish Peroxidase conjucated secondary antibody |
| BDoptEIA TMB reagent set | BD Biosciences | 555214 | ELISA – TMB substrate solution |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Fulka | 84720 | 5N H2SO4 (Enzyme reaction stop solution) |
| Synergy/H1 – Microplate reader | BioTeK | ELISA plate reader |
Riferimenti
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