ELISA на основе связывания и метод конкуренции быстро определить лиганд-рецепторных взаимодействий
Summary
The presented protocols describe two enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) based techniques for the rapid investigation of ligand-receptor interactions: The first assay allows the determination of dissociation constant between ligand and receptor. The second assay enables a rapid screening of blocking peptides for ligand-receptor interactions.
Abstract
A comprehensive understanding of signaling pathways requires detailed knowledge regarding ligand-receptor interaction. This article describes two fast and reliable point-by-point protocols of enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) for the investigation of ligand-receptor interactions: the direct ligand-receptor interaction assay (LRA) and the competition LRA. As a case study, the ELISA based analysis of the interaction between different lambda interferons (IFNLs) and the alpha subunit of their receptor (IL28RA) is presented: the direct LRA is used for the determination of dissociation constants (KD values) between receptor and IFN ligands, and the competition LRA for the determination of the inhibitory capacity of an oligopeptide, which was designed to compete with the IFNLs at their receptor binding site. Analytical steps to estimate KD and half maximal inhibitory concentration (IC50) values are described. Finally, the discussion highlights advantages and disadvantages of the presented method and how the results enable a better molecular understanding of ligand-receptor interactions.
Introduction
Полное понимание сигнальных путей требует детального знания о взаимодействии лиганд-рецептор. Большинство методов оценки взаимодействия конкретного лиганда с его специфическим рецептором являются дорогостоящими, отнимает много времени, трудоемкими и требуют специального оборудования и опыта 1.
В данной статье описываются два быстрых и надежных протоколов точка за точкой для исследования взаимодействия лиганд-рецептор на основе иммуноферментного анализа (ИФА): анализ на прямой лиганд-рецептор взаимодействия (LRA) и конкуренция LRA. ELISA является высокочувствительным, специфические и легко доступны метод, обычно используется почти в каждой лаборатории. ELISA, могут быть выполнены и адаптированы в различных модах. Представленные протоколы оптимизированы для изучения взаимодействия между различными интерферонами лямбда (INFLs) и их рецепторов.
Прямой LRA позволяет использовать quantificatiна лиганд-рецептор связывания в отношении концентрации лиганда и, таким образом, дает кривую связывания. С помощью соответствующего модели взаимодействия лиганд-рецептор, эти данные могут быть дополнительно проанализированы , чтобы оценить константу диссоциации (K D).
В представленном протоколе, обычно используется уравнение Хилла применяется для моделирования лиганд-рецептор связывания. Хотя другие методы , такие как поверхностного плазмонного резонанса технологии 2,3 позволяют определить аффинности связывания между двумя белками, эта технология часто трудоемкий, дорогой и требует специального лабораторного оборудования.
Конкурс LRA позволяет скрининг ингибирующих пептидов: лиганд-рецептор связывания количественно по отношению к концентрации пептида. Это дает кривую доза-ответ, описывающую ингибирующее действие пептида. Данные могут быть дополнительно проанализированы , чтобы оценить максимальную концентрацию ингибирования половину (IC 50 </суб>) блокирующего пептида.
Оба протокола ELISA просты в использовании, и может быть адаптирован к широкому кругу вопросов исследования. Рекомбинантные белки любого типа могут быть использованы, чтобы надежно и быстро определить детали взаимодействия. Кроме того, конкуренция LRA может быть использован для определения критических участков взаимодействия лигандов и рецепторов с использованием блокирующих пептидов, которые предназначены для имитации либо лиганд, либо рецептор. Если блокирующий пептид показывает эффективное и специфическое ингибирование, пептид занимает критический сайт взаимодействие лиганда (если пептид имитирует рецептор) или лиганда (если пептид имитирует лиганд).
Первый протокол описывает определение K D значение различных INFLs и альфа – субъединицу их рецепторов, т.е. интерлейкин-28 – рецептора (IL28RA) с использованием прямого LRA. Далее, второй протокол показывает, как определить способность 20 аминокислот, длинного пептидаингибируют взаимодействие INFL-IL28RA. Пептид предназначен, чтобы конкурировать с IFNLs на их сайт связывания с рецептором и, таким образом, позволяет молекулярное понимание взаимодействия. Кроме того, этот пептид может быть использован для блокирования IL28RA в экспериментах в пробирке , чтобы определить влияние на нижестоящих сигнальных эффектов 4.
Protocol
Representative Results
Discussion
ELISA является стандартным и хорошо общепризнанный метод для многих лабораторий. Далее мы изменены и улучшены ранее опубликованного метода 5,7. Продемонстрировал шаг за шагом протокол показывает , как он может быть использован в простой способ для определения значений K D взаи?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Prof. J. Stelling (Department of Biosystems Science and Engineering, ETH Zurich and Swiss Institute for Bioinformatics, Basel, Switzerland) for his critical review of the manuscript.
Materials
| Nunc-Immunoplate (F96 Maxi sorp) | Thermo Scientific | 442404 | ELISA plate |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Merck | 497-19-8 | For ELISA plate coating buffer |
| Sodium hydrogen carbomnate(NaHCO3) | Merck | 144-55-8 | For ELISA plate coating buffer |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030-100G | 5% BSA in PBS for Blocking |
| rhIL-28Rα/IFNλR1 | R&D systems | 5260-MR | Recombinant human interlukin-28 Receptor alpha |
| rhIL-29/IFNλ1 | R&D systems | 1598-IL/CF | Recombinant human interlukin-29/Carrier free/C-terminal 10-His tag |
| rhIL-28A/IFNλ2 | R&D systems | 1587-IL/CF | Recombinant human interlukin-28A/Carrier free/C-terminal 6-His tag |
| rhIL-28B/IFNλ3 | R&D systems | 5259-IL/CF | Recombinant human interlukin-28B/Carrier free/C-terminal 6-His tag |
| 6X His Monoclonal antibody (Mouse) | Clontech | 631212 | Primary antiboy to capture His tagged Ligands |
| Goat anti-Mouse igG (H+L) | Jackson Immuno Research | 115-035-166 | Horseradish Peroxidase conjucated secondary antibody |
| BDoptEIA TMB reagent set | BD Biosciences | 555214 | ELISA – TMB substrate solution |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Fulka | 84720 | 5N H2SO4 (Enzyme reaction stop solution) |
| Synergy/H1 – Microplate reader | BioTeK | ELISA plate reader |
Riferimenti
- Schneider, P., Willen, L., Smulski, C. R. Tools and techniques to study ligand-receptor interactions and receptor activation by TNF superfamily members. Methods in enzymology. 545, 103-125 (2014).
- Rossi, G., et al. Biosensor analysis of anti-citrullinated protein/peptide antibody affinity. Analytical biochemistry. 465, 96-101 (2014).
- van der Merwe, P. A., Barclay, A. N. Analysis of cell-adhesion molecule interactions using surface plasmon resonance. Curr Opin Immunol. 8, 257-261 (1996).
- Egli, A., et al. IL-28B is a key regulator of B- and T-cell vaccine responses against influenza. PLoS Pathog. 10, e1004556 (2014).
- Rosenbluh, J., et al. Positively charged peptides can interact with each other, as revealed by solid phase binding assays. Analytical biochemistry. 352, 157-168 (2006).
- Goutelle, S., et al. The Hill equation: a review of its capabilities in pharmacological modelling. Fundamental & clinical pharmacology. 22, 633-648 (2008).
- Levin, A., et al. Peptides derived from HIV-1 integrase that bind Rev stimulate viral genome integration. PLoS One. 4, e4155 (2009).
- Egli, A., Santer, M. D., O’Shea, D., Tyrrell, D. L., Houghton, M. The impact of the interferon-lambda family on the innate and adaptive immune response to viral infections. Emerging infectious diseases. , e51 (2014).
- Gad, H. H., Hamming, O. J., Hartmann, R. The structure of human interferon lambda and what it has taught us. J Interferon Cytokine Res. 30, 565-571 (2010).
- Folch, B., Rooman, M., Dehouck, Y. Thermostability of salt bridges versus hydrophobic interactions in proteins probed by statistical potentials. Journal of chemical information and modeling. 48, 119-127 (2008).
- Yuzlenko, O., Lazaridis, T. Interactions between ionizable amino acid side chains at a lipid bilayer-water interface. The journal of physical chemistry. B. 115, 13674-13684 (2011).
- Tissot, A. C., Vuilleumier, S., Fersht, A. R. Importance of two buried salt bridges in the stability and folding pathway of barnase. Biochimica. 35, 6786-6794 (1996).
