En ELISA baserad Bindning och konkurrens metod för att snabbt bestämma ligand-receptorinteraktioner
Summary
The presented protocols describe two enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) based techniques for the rapid investigation of ligand-receptor interactions: The first assay allows the determination of dissociation constant between ligand and receptor. The second assay enables a rapid screening of blocking peptides for ligand-receptor interactions.
Abstract
A comprehensive understanding of signaling pathways requires detailed knowledge regarding ligand-receptor interaction. This article describes two fast and reliable point-by-point protocols of enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) for the investigation of ligand-receptor interactions: the direct ligand-receptor interaction assay (LRA) and the competition LRA. As a case study, the ELISA based analysis of the interaction between different lambda interferons (IFNLs) and the alpha subunit of their receptor (IL28RA) is presented: the direct LRA is used for the determination of dissociation constants (KD values) between receptor and IFN ligands, and the competition LRA for the determination of the inhibitory capacity of an oligopeptide, which was designed to compete with the IFNLs at their receptor binding site. Analytical steps to estimate KD and half maximal inhibitory concentration (IC50) values are described. Finally, the discussion highlights advantages and disadvantages of the presented method and how the results enable a better molecular understanding of ligand-receptor interactions.
Introduction
En omfattande förståelse av signalvägar kräver detaljerad kunskap om ligand-receptorinteraktionen. De flesta metoder för att bedöma samverkan av en viss ligand med dess specifika receptor är dyra, tidskrävande, arbetsintensiv och kräver särskild utrustning och kompetens en.
I artikeln beskrivs två snabba och pålitliga punkt-för-punkt-protokoll för att undersöka ligand-receptorinteraktion baserad på en enzymkopplad immunabsorberande analys (ELISA): den direkta ligand-receptorinteraktion assay (LRA) och konkurrensen LRA. ELISA är en mycket känslig, specifik och lätt tillgänglig teknik, som rutinmässigt används i nästan varje laboratorium. ELISA kan utföras och anpassas på olika sätt. De presenterade protokoll är optimerade för undersökning av samspelet mellan olika lambda interferoner (INFLs) och deras receptor.
Den direkta LRA tillåter en quantificatipå ligand-receptorbindning i förhållande till ligandkoncentration och därmed ger en bindningskurva. Användning av en lämplig modell för ligand-receptor-interaktion, kan data analyseras ytterligare för att uppskatta dissociationskonstanten (K D).
I det presenterade protokollet är vanligt förekommande Hill ekvation gäller att modellera ligand-receptorbindning. Även om andra metoder såsom ytplasmonresonans teknik 2,3 tillåter bestämningen av bindningsaffiniteter mellan två proteiner, är denna teknik ofta arbetsintensiv, dyr och kräver speciell laboratorieutrustning.
Tävlingen LRA möjliggör screening av hämmande peptider: Ligand-receptorbindnings kvantifieras med avseende på peptidkoncentration. Detta ger en dos-responskurva som beskriver den inhiberande effekten av peptiden. Data kan analyseras ytterligare för att uppskatta halv maximal inhiberande koncentration (IC 50 </sub>) av blockerings peptiden.
Både ELISA-protokoll är lätta att använda och kan anpassas till ett brett spektrum av forskningsfrågor. Rekombinanta proteiner av alla slag kan användas för att på ett tillförlitligt och snabbt bestämma interaktions delar. Dessutom kan tävlingen LRA användas för att bestämma kritiska interaktionsställen på ligander och receptorer med hjälp av blockerande peptider, som är utformade för att efterlikna antingen liganden eller receptorn. Om blockerings peptiden visar effektiv och specifik hämning upptar peptiden en kritisk interaktion platsen för liganden (om peptiden härmar receptor) eller ligand (om peptid efterliknar liganden).
Det första protokollet beskriver K D-värde bestämning av olika INFLs och alfa-subenheten av sin receptor, dvs interleukin-28-receptorn (IL28RA) använda den direkta LRA. Därefter visar det andra protokollet hur man bestämmer förmågan hos en 20 aminosyror lång peptid tillinhibera INFLATIONS-IL28RA interaktioner. Peptiden är utformad för att konkurrera med IFNLs på deras receptorbindningsstället och möjliggör således en molekylär förståelse av interaktionen. Dessutom kan denna peptid användas för att blockera IL28RA i in vitro experiment för att bedöma effekten på nedströms signaleffekter 4.
Protocol
Representative Results
Discussion
ELISA är en standard och väletablerad metod för många laboratorier. Vi har ytterligare modifierad och förbättrad en tidigare publicerad metod 5,7. Den demonstrerade steg-för-steg-protokoll visar hur den kan användas på ett enkelt sätt för att bestämma K-värden av ligand-receptorinteraktioner. Dessutom kan IC50 för en blockerande peptid som stör ligand-receptorinteraktionen bestämmas.
Stora fördelar är den snabba installationen enkel framställning av r…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Prof. J. Stelling (Department of Biosystems Science and Engineering, ETH Zurich and Swiss Institute for Bioinformatics, Basel, Switzerland) for his critical review of the manuscript.
Materials
| Nunc-Immunoplate (F96 Maxi sorp) | Thermo Scientific | 442404 | ELISA plate |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Merck | 497-19-8 | For ELISA plate coating buffer |
| Sodium hydrogen carbomnate(NaHCO3) | Merck | 144-55-8 | For ELISA plate coating buffer |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030-100G | 5% BSA in PBS for Blocking |
| rhIL-28Rα/IFNλR1 | R&D systems | 5260-MR | Recombinant human interlukin-28 Receptor alpha |
| rhIL-29/IFNλ1 | R&D systems | 1598-IL/CF | Recombinant human interlukin-29/Carrier free/C-terminal 10-His tag |
| rhIL-28A/IFNλ2 | R&D systems | 1587-IL/CF | Recombinant human interlukin-28A/Carrier free/C-terminal 6-His tag |
| rhIL-28B/IFNλ3 | R&D systems | 5259-IL/CF | Recombinant human interlukin-28B/Carrier free/C-terminal 6-His tag |
| 6X His Monoclonal antibody (Mouse) | Clontech | 631212 | Primary antiboy to capture His tagged Ligands |
| Goat anti-Mouse igG (H+L) | Jackson Immuno Research | 115-035-166 | Horseradish Peroxidase conjucated secondary antibody |
| BDoptEIA TMB reagent set | BD Biosciences | 555214 | ELISA – TMB substrate solution |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Fulka | 84720 | 5N H2SO4 (Enzyme reaction stop solution) |
| Synergy/H1 – Microplate reader | BioTeK | ELISA plate reader |
Riferimenti
- Schneider, P., Willen, L., Smulski, C. R. Tools and techniques to study ligand-receptor interactions and receptor activation by TNF superfamily members. Methods in enzymology. 545, 103-125 (2014).
- Rossi, G., et al. Biosensor analysis of anti-citrullinated protein/peptide antibody affinity. Analytical biochemistry. 465, 96-101 (2014).
- van der Merwe, P. A., Barclay, A. N. Analysis of cell-adhesion molecule interactions using surface plasmon resonance. Curr Opin Immunol. 8, 257-261 (1996).
- Egli, A., et al. IL-28B is a key regulator of B- and T-cell vaccine responses against influenza. PLoS Pathog. 10, e1004556 (2014).
- Rosenbluh, J., et al. Positively charged peptides can interact with each other, as revealed by solid phase binding assays. Analytical biochemistry. 352, 157-168 (2006).
- Goutelle, S., et al. The Hill equation: a review of its capabilities in pharmacological modelling. Fundamental & clinical pharmacology. 22, 633-648 (2008).
- Levin, A., et al. Peptides derived from HIV-1 integrase that bind Rev stimulate viral genome integration. PLoS One. 4, e4155 (2009).
- Egli, A., Santer, M. D., O’Shea, D., Tyrrell, D. L., Houghton, M. The impact of the interferon-lambda family on the innate and adaptive immune response to viral infections. Emerging infectious diseases. , e51 (2014).
- Gad, H. H., Hamming, O. J., Hartmann, R. The structure of human interferon lambda and what it has taught us. J Interferon Cytokine Res. 30, 565-571 (2010).
- Folch, B., Rooman, M., Dehouck, Y. Thermostability of salt bridges versus hydrophobic interactions in proteins probed by statistical potentials. Journal of chemical information and modeling. 48, 119-127 (2008).
- Yuzlenko, O., Lazaridis, T. Interactions between ionizable amino acid side chains at a lipid bilayer-water interface. The journal of physical chemistry. B. 115, 13674-13684 (2011).
- Tissot, A. C., Vuilleumier, S., Fersht, A. R. Importance of two buried salt bridges in the stability and folding pathway of barnase. Biochimica. 35, 6786-6794 (1996).
