Um ELISA baseada Encadernação e Método de competição de determinar rapidamente interacções ligando-receptor
Summary
The presented protocols describe two enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) based techniques for the rapid investigation of ligand-receptor interactions: The first assay allows the determination of dissociation constant between ligand and receptor. The second assay enables a rapid screening of blocking peptides for ligand-receptor interactions.
Abstract
A comprehensive understanding of signaling pathways requires detailed knowledge regarding ligand-receptor interaction. This article describes two fast and reliable point-by-point protocols of enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) for the investigation of ligand-receptor interactions: the direct ligand-receptor interaction assay (LRA) and the competition LRA. As a case study, the ELISA based analysis of the interaction between different lambda interferons (IFNLs) and the alpha subunit of their receptor (IL28RA) is presented: the direct LRA is used for the determination of dissociation constants (KD values) between receptor and IFN ligands, and the competition LRA for the determination of the inhibitory capacity of an oligopeptide, which was designed to compete with the IFNLs at their receptor binding site. Analytical steps to estimate KD and half maximal inhibitory concentration (IC50) values are described. Finally, the discussion highlights advantages and disadvantages of the presented method and how the results enable a better molecular understanding of ligand-receptor interactions.
Introduction
Uma compreensão abrangente de vias de sinalização requer conhecimento detalhado sobre a interação ligando-receptor. A maioria dos métodos para avaliar a interacção de um ligando particular com o seu receptor específico são caros, consomem tempo, trabalho intensivo e exige equipamentos e conhecimentos específicos 1.
Este artigo descreve dois protocolos rápidos e fiáveis ponto-a-ponto para investigar a interacção ligando-receptor baseado em um ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA): o ensaio de interacção ligando-receptor directa (ERS) e o LRA competição. ELISA é uma técnica altamente sensível, específico e facilmente disponível, rotineiramente utilizados em quase todos os laboratórios. ELISA pode ser realizada e adaptada de diversas formas. Os protocolos apresentados são otimizados para a investigação da interação entre diferentes interferons lambda (INFLs) e seu receptor.
O LRA direta permite uma quantificatina de ligação ligando-receptor em relação à concentração do ligando e, portanto, produz uma curva de ligação. Usando um modelo apropriado para a interacção ligando-receptor, os dados podem ainda ser analisados para se avaliar a constante de dissociação (K D).
No protocolo apresentado, a equação de Hill vulgarmente utilizado é aplicada para modelar a ligação do ligando ao receptor. Embora outros métodos, tais como a tecnologia de ressonância de plasmon de superfície 2,3 permitir a determinação das afinidades de ligação entre as duas proteínas, esta tecnologia é muitas vezes um trabalho intensivo e caro, e requer equipamento laboratorial especial.
O LRA competição permite o rastreio de péptidos inibidores: A ligação ligando-receptor é quantificada em relação à concentração de péptido. Obteve-se uma curva de dose-resposta que descreve o efeito inibidor do péptido. Os dados podem ainda ser analisados para se estimar a concentração inibitória máxima metade (IC50 </sub>) do péptido de bloqueio.
Ambos os protocolos de ELISA são fáceis de utilizar e podem ser adaptadas a uma ampla variedade de questões de pesquisa. As proteínas recombinantes, de qualquer tipo pode ser utilizada para determinar de forma fiável e rápida das peças de interacção. Além disso, o LRA competição pode ser usado para determinar sítios de interacção fundamentais de ligandos e receptores, utilizando os péptidos de bloqueio, que são concebidos para imitar ou o ligando ou o receptor. Se o péptido de bloqueio apresenta uma inibição eficiente e específico, o péptido ocupa um local crítico interacção do ligando (se o péptido imita o receptor) ou do ligando (se o péptido imita o ligando).
O primeiro protocolo descreve a determinação de K D valor de diferentes INFLs e a subunidade alfa do seu receptor, isto é, o receptor de interleucina-28 (IL28RA) usando o LRA directa. Em seguida, o segundo protocolo mostra como para determinar a capacidade de um péptido de comprimento de 20 aminoácidos deinibir as interacções INFL-IL28RA. O péptido é concebido para competir com IFNLs no seu local de ligação ao receptor e, portanto, permite uma compreensão molecular da interacção. Além disso, este péptido pode ser utilizado para bloquear IL28RA em experiências in vitro para determinar o impacto sobre os efeitos de sinalização a jusante 4.
Protocol
Representative Results
Discussion
ELISA é um método padrão e bem estabelecido para muitos laboratórios. Temos ainda mais modificado e melhorado a 5,7 método previamente publicado. O protocolo passo-a-passo demonstrou mostra como ela pode ser usada de uma maneira simples para determinar os valores de KD de interacções ligando-receptor. Além disso, pode ser determinado o IC50 de um péptido de bloqueio que interfere com a interacção ligando-receptor.
As principais vantagens são a rápida instal…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Prof. J. Stelling (Department of Biosystems Science and Engineering, ETH Zurich and Swiss Institute for Bioinformatics, Basel, Switzerland) for his critical review of the manuscript.
Materials
| Nunc-Immunoplate (F96 Maxi sorp) | Thermo Scientific | 442404 | ELISA plate |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Merck | 497-19-8 | For ELISA plate coating buffer |
| Sodium hydrogen carbomnate(NaHCO3) | Merck | 144-55-8 | For ELISA plate coating buffer |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030-100G | 5% BSA in PBS for Blocking |
| rhIL-28Rα/IFNλR1 | R&D systems | 5260-MR | Recombinant human interlukin-28 Receptor alpha |
| rhIL-29/IFNλ1 | R&D systems | 1598-IL/CF | Recombinant human interlukin-29/Carrier free/C-terminal 10-His tag |
| rhIL-28A/IFNλ2 | R&D systems | 1587-IL/CF | Recombinant human interlukin-28A/Carrier free/C-terminal 6-His tag |
| rhIL-28B/IFNλ3 | R&D systems | 5259-IL/CF | Recombinant human interlukin-28B/Carrier free/C-terminal 6-His tag |
| 6X His Monoclonal antibody (Mouse) | Clontech | 631212 | Primary antiboy to capture His tagged Ligands |
| Goat anti-Mouse igG (H+L) | Jackson Immuno Research | 115-035-166 | Horseradish Peroxidase conjucated secondary antibody |
| BDoptEIA TMB reagent set | BD Biosciences | 555214 | ELISA – TMB substrate solution |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Fulka | 84720 | 5N H2SO4 (Enzyme reaction stop solution) |
| Synergy/H1 – Microplate reader | BioTeK | ELISA plate reader |
Riferimenti
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