Genome editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) can be done quickly and efficiently. Presented here is a robust experimental procedure to genetically engineer hPSCs as exemplified by editing the AAVS1 safe harbor locus to express EGFP and introduce antibiotic resistance.
Genome-editing di cellule staminali umane pluripotenti (hPSCs) fornisce una piattaforma geneticamente controllata e clinicamente rilevante da cui partire per comprendere lo sviluppo umano e indagare la fisiopatologia della malattia. Utilizzando nucleasi site-specific (SSN) per la modifica del genoma, la rapida derivazione di nuove linee HPSC ospitano specifiche alterazioni genetiche in un ambiente altrimenti isogenico diventa possibile. Zinc finger nucleasi (ZFNs), trascrizione nucleasi attivatore-come effettrici (Talens) e cluster brevi ripetizioni palindromiche regolarmente intervallati (CRISPR) / Cas9 sono i SSNs più comunemente utilizzati. Tutti questi nucleasi funzionano con l'introduzione di una doppia interruzione di DNA incagliato in un sito specificato, promuovendo in tal modo preciso l'editing gene ad un locus genomico. SSN-meditato editing genoma sfrutta due dei meccanismi endogeni della cellula di riparazione del DNA, che unisce non omologhe fine (NHEJ) e omologia riparazione diretta (HDR), a uno introdurre inserzione / delezione mutazioni o alter il genoma utilizzando un modello di riparazione omologa al sito della doppia interruzione filamento. L'elettroporazione di hPSCs è un mezzo efficace per trasfezione SSNs e modelli di riparazione che incorporano i transgeni come reporter fluorescenti e cassette di resistenza agli antibiotici. Dopo l'elettroporazione, è possibile isolare solo le hPSCs che incorporavano il costrutto riparazione selezionando per la resistenza agli antibiotici. Meccanicamente separando colonie HPSC e confermando la corretta integrazione al sito bersaglio attraverso genotipizzazione consente l'isolamento di linee cellulari sono correttamente orientati e geneticamente omogenee. La validità di questo protocollo è dimostrato qui utilizzando tutte e tre le piattaforme del SSN per incorporare EGFP e una resistenza puromicina costruire nel AAVS1 sicuro locus porto di cellule staminali pluripotenti umane.
Tecnologie di modifica del genoma stanno rapidamente evolvendo in strumenti standard per la biologia molecolare e cellulare 1. L'ingegneria genetica di cellule umane staminali pluripotenti (hPSCs) è di particolare interesse come hPSCs rappresentano una fonte di auto-rinnovamento delle cellule umane primarie geneticamente intatte. hPSCs possono essere differenziati in vari tipi di cellule per la modellazione della malattia o come fonte per le terapie di trapianto 2,3. Ha dimostrato qui è un protocollo che utilizza tre diversi tipi di nucleasi site-specific (SSN) in combinazione con i meccanismi endogeni di riparazione del DNA per l'integrazione mirata di un costrutto giornalista nel locus AAVS1. Dopo trasfezione di SSNs in hPSCs, dimostriamo come isolare popolazioni di cellule isogeniche ospitare il giornalista.
La capacità di manipolare il genoma, in particolare pluripotenti staminali genomi di cellule, utilizzando SSN non è un fenomeno nuovo, come l'utilità di nucleasi dita di zinco (ZFNs) e trascrizione attivata sianucleasi effettrici o simili (Talens) per la modifica del gene è stata dimostrata diversi anni fa 4-10. Tuttavia, con l'avvento di S. pyogenes CRISPR / tecnologia Cas9 11-13, editing gene è diventato ampiamente accessibili 14. Tutti SSNs introducono una doppia interruzione di DNA filamento (DSB) presso il sito di destinazione specificata 1,4,5,11 che viene riparato da meccanismi cellulari endogeni utilizzando riparazione non omologa end-joining (NHEJ) o omologia diretto (HDR) 15. NHEJ è soggetto a errori e può introdurre mutazioni frame-shift con conseguente perdita della funzione del gene, mentre HDR permette di nuovi elementi da introdurre attraverso la co-trasfezione di un modello di riparazione con il SSN. Mentre i principi alla base di riparazione del DNA che facilitano l'editing gene sono pensati per essere in gran parte la stessa per ogni SSN, alcune differenze tra le piattaforme possono essere osservato. De novo design ZFNs consente flessibilità e ottimizzazione nucleasi 16, tuttavia l'uso di pubblicamentebiblioteche di montaggio disponibili e strumenti di screening per progettare i singoli ZFNs può richiedere molto tempo. Una volta che il luogo desiderato per il targeting ZFN-mediata è determinato, coppie ZFN possono essere progettati con lo strumento online ZiFit 17. Dopo la progettazione, ZFNs può essere modulare assemblato attraverso vari cicli di plasmide clonazione 18. In alternativa, ci sono molti disponibili in commercio, ZFNs preconvalidati 19. Nucleasi TALE possono anche essere progettati utilizzando strumenti online e componenti disponibili pubblicamente 17,20. Ad esempio, Talens può essere rapidamente assemblato da blocchi di cinque ripetizioni racconto, attraverso il montaggio FLASH 21 o mediante PCR basato gerarchica Golden Gate complesso 22. Facilità di progettazione SSN e la velocità di costruzione utilizzando CRISPR / Cas9 hanno fatto genoma modifica di uno strumento ampiamente accessibile. La breve guida di RNA-mediata di mira CRISPR / Cas9 consente anche di multiplazione di RNA guida per indirizzare diversi loci con un unico costrutto 14. Il designdi Cas9 per la modifica genetica richiede solo l'individuazione di un motivo adiacente protospacer (PAM, un trinucleotide NGG per S. Pirogeni Cas9) prossimale al locus bersaglio. Inserendo un oligonucleotide corrispondente ai 20 coppie di basi 5 'del PAM nel plasmide px330 14, il costrutto può essere assemblato in un passo clonazione. Oltre a S. pyogenes Cas9, Cas9 da N. meningitidis (NmCas9) che riconosce un 5'-NNNNGATT-3 '(PAM) ha dimostrato di consentire efficiente gene-editing in hPSCs 23.
Oltre alle differenze nella facilità di progettazione SSN, ogni piattaforma ha proprietà specifiche. Ad esempio, ZFNs e Talens utilizzano il dominio nucleasi FokI, che genera un quattro nucleotidi 5 'sbalzo 24 mentre Cas9 è pensato per generare la maggior parte smussare DSBs indeterminato. ZFNs, Talens e Cas9 differiscono nella loro stabilità della proteina, tasso on-off sul DNA bersaglio, e la modalità di scansione DNA, i quali could teoricamente comportare piccole differenze nei risultati editing 1. Mentre saranno necessari ulteriori studi per comprendere appieno le conseguenze di queste differenze, si descrive qui un protocollo che sia molto robusto in tutte e tre le piattaforme e può essere utilizzato per generare facilmente hPSCs geneticamente modificati.
Indipendentemente dalla scelta SSN, elettroporazione è una procedura affidabile per trasfettare SSNs e modelli di riparazione omologia in hPSCs 25. Il numero di sopravvivere colonie dopo la selezione per la resistenza agli antibiotici dipende da parametri specifici del locus e la strategia di modifica (ad esempio, le dimensioni di inserto transgenico e le modalità di selezione). Il protocollo descritto qui di solito si traduce in circa 150-400 colonie cella singola derivati.
-Gene editing al locus AAVS1 utilizzo di questo protocollo è stato precedentemente utilizzato per dimostrare l'efficacia di SSNs 4,5. Il modello di riparazione AAV-CAGGS-EGFP utilizza una str trappola geneategy conferire resistenza puromicina in modo specifico locus. In breve, il modello di riparazione contiene un sito splice accettore monte della cassetta promoterless resistenza puromicina. Su corretta integrazione nel primo introne del gene PPP1R12C al locus AAVS1, la cassetta di resistenza è espresso dal promotore del gene modificato. La robustezza di questo test AAVS1 specifica ci permette di confrontare l'efficienza di ogni piattaforma SSN.
Editing gene utilizzando SSNs è potente data la capacità di interrompere e / o modificare teoricamente qualsiasi gene. Applicando questa strategia hPSCs fornisce versatilità hPSCs possono essere successivamente differenziate in una moltitudine di tipi di cellule umane come i neuroni 26, epatociti 27 e 28 cardiomiociti. Inoltre, l'uso di cellule staminali pluripotenti indotte derivati da pazienti consente la riparazione o l'introduzione di mutazioni patogeni noti in un background genetico specifico paziente 29 </sup>, Fornendo una piattaforma da cui partire per indagare i meccanismi della malattia e terapie di prova che utilizzano le proprie cellule del paziente 30. In sintesi, la modifica gene in hPSCs è un approccio efficiente e versatile per studiare la biologia di base dello sviluppo umano e della malattia 31.
Il metodo presentato qui per isolare popolazioni omogenee di cellule staminali umane pluripotenti geni modificati è un approccio potente per la generazione di linee isogeniche HPSC che differiscono solo a livello del locus mirato. Queste cellule sono un sistema ideale per sondare i meccanismi di differenziazione cellulare umana e sviluppo, nonché per comprendere la fisiopatologia di malattie monogeniche in un ambiente controllato genetica. Come dimostrato qui, è possibile utilizzare tre strategie progettuali SSN indipendenti (ZFNs, Talens, e CRISPR / Cas9) per realizzare l'integrazione mirata al locus AAVS1. Ciascuno di questi metodi ha i suoi vantaggi e svantaggi. Un vantaggio potenziale di ZFNs e, in una certa misura, Talens è la flessibilità del disegno, che consente ingegneria iterativo per migliorare la dominii singoli nucleasi 42 legame al DNA. Questa ottimizzazione nucleasi potrebbe aumentare la specificità della ZFNs e Talens là di ciò che è realizzabile con la CRISistema SPR / Cas9. Tale selettività può essere importante per applicazioni cliniche che richiedono un alto grado di specificità di destinazione. Il vantaggio principale del sistema / Cas9 CRISPR è la facilità d'uso. Sebbene kit di costruzione Talen e ZFN sono stati messi a disposizione del pubblico (ad esempio, attraverso Addgene 21), CRISPR / SSNs basate Cas9 sono notevolmente più facili da costruire, come l'unica personalizzazione necessaria è una coppia di oligonucleotidi 20 di base (quando si utilizza il plasmide px330 disegno 14). Questa semplicità si rivela vantaggiosa per laboratori di ricerca che desiderano includere la modifica del genoma nei loro studi.
Ci sono tecniche di trasfezione alternative, tra cui nucleofection 43, per creare linee HPSC geni modificati; tuttavia elettroporazione ha dimostrato di essere efficace 4,5,25 coerenti ed economicamente. Nucleofection può essere utilizzato per trasfettare direttamente Cas9-guida i complessi RNA ribonucleoproteina nel nucleo, aumentando l'efficienza di un SSNd fedeltà 44. Crescere hPSCs su MEF è un metodo affidabile e poco costoso da mantenere hPSCs in uno stato pluripotente, senza differenziazione eccessiva. Inoltre, esso permette una facile isolamento di colonie geneticamente identici. In alternativa, è possibile hPSCs cultura senza MEF, tuttavia queste condizioni di coltura può essere più costoso di culture fondate alimentazione. Inoltre, l'intero processo è scalabile, consentendo l'isolamento di modifica degli eventi molto rari o la generazione di molte linee cellulari distinti esperimenti montaggio parallelo.
Il protocollo qui descritto è robusto; tuttavia ci sono diversi passaggi chiave che influenzano l'efficienza con cui si possono ottenere cloni modificati correttamente. La componente più critico per questo metodo è avere MEF di alta qualità e resistenti ai farmaci MEF DR4. La sopravvivenza di singoli hPSCs è tenue, e MEFs bassa qualità impedirà l'isolamento di linee HPSC indifferenziate. In secondo luogo, l'uso di Y-27632 è anchechiave per consentire la sopravvivenza delle cellule unico senza generare una pressione selettiva per le cellule con un cariotipo anormale 45. In terzo luogo, la raccolta colonie ben distanziati assicura omogeneità genetica delle linee cellulari derivate. Infine, è importante preparare pipette di vetro in modo che l'apertura è abbastanza piccolo per rompere la colonia in molti pezzi più piccoli, in modo che più colonie crescere nel nuovo pozzo. Questo permette la raccolta di sottocloni ben distanziati per un piatto replica di avere nella cultura, lasciando il piatto originale di colonie isolate per la genotipizzazione. Una parte difficile in questo protocollo è il manuale di trazione delle pipette di vetro; questo dovrebbe essere praticata in anticipo. Va notato che ci sono più tecniche di raccolta clone che non richiedono una pipetta di vetro. Gli sperimentatori sono incoraggiati a trovare quello che funziona meglio per loro.
Ci sono limitazioni a questo protocollo che può essere superato con semplici modifiche. Un esperimento destinato a oolo interrompere il luogo di interesse, senza riparazione o uno il cui modello di riparazione non contiene una cassetta di selezione, deve utilizzare un altro metodo di arricchimento per le cellule che sono state modificate. Si noti che il numero di colonie che devono essere raccolti per trovare un clone positivo aumenta notevolmente in assenza di selezione. Una strategia per migliorare l'efficienza è co-trasfezione un plasmide non integranti che esprime una proteina fluorescente. Dopo permettendo alle cellule di recuperare per due giorni, le cellule mirate possono essere ordinati su fluorescenza positiva utilizzando la fluorescenza-attivato l'ordinamento delle cellule e ripiastrate 29. Questo processo arricchisce di cellule che sono state trasfettate con i plasmidi di elettroporazione e quindi aumenta la probabilità di un evento di editing concomitante nella cellula.
Le tecniche qui descritte possono essere estesi ad utilizzare più RNA guida per indirizzare simultaneamente diversi loci 14,46,47. Sono stati stabiliti molti protocolli di differenziare hPSCsin tipi di cellule diverse, consentendo varie manipolazioni genetiche in tipi cellulari di interesse 30. Nel complesso, abbiamo dimostrato il potenziale per un efficiente modifica del genoma in hPSCs indipendentemente dalla scelta SSN. Si propone che questa tecnica può essere adattato per creare linee isogeniche HPSC che sono state gene-modificati in qualsiasi locus genomico.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato sostenuto da un seme di Grant cervello Research Foundation (BRFSG-2014-02) per Helen Bateup. Dirk Hockemeyer è un nuovo Scholar in invecchiamento della Ellison Medical Foundation ed è supportato dalla Fondazione Glenn così come The Shurl e Kay Curci Foundation. DH è supportato anche dal NIH concedere 1R01CA196884-01.
DMEM/F12 | Life Technologies | 11320082 | |
Fetal Bovine Serum (HI) | Life Technologies | 10082-147 | |
Knockout Serum | Life Technologies | 10828-028 | |
Fibroblast Growth Factor – basic | Life Technologies | PHG0261 | |
Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 | |
Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
MEM NEAA | Life Technologies | 11140-050 | |
2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
Y-27632 | Calbiochem | 688000 | |
6-well plates | Corning | 3506 | |
12-well plates | Corning | 3512 | |
4mm Electroporation cuvettes | Bio-rad | 165-2081 | |
X-cel gene pulser II | Bio-rad | 165-2661 | |
0.25 % Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-056 | |
10× Phosphate buffered saline (PBS) pH7.4 | Life Technologies | 70011-044 | |
Puromycin | Life Technologies | A11138-02 | |
Pasteur pipettes, plugged | VWR | 14672-412 | |
Tris-HCl | Sigma-Aldrich | S5941 | |
NaCL | Sigma-Aldrich | S9888 | |
SDS | Sigma-Aldrich | L3771 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
Proteinase-K | Life Technologies | AM2544 | |
Ethanol | VWR | TX89125-172SFU | |
Isopropyl Alcohol | VWR | MK303216 | |
TE Buffer | Life Technologies | 12090-015 | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
1.8 ml Cryotubes | ThermoScientific | 377267 |