Genome editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) can be done quickly and efficiently. Presented here is a robust experimental procedure to genetically engineer hPSCs as exemplified by editing the AAVS1 safe harbor locus to express EGFP and introduce antibiotic resistance.
인간 다 능성 줄기 세포 (hPSCs)의 게놈 편집은 인간 발달을 이해하고 질병의 병태 생리를 조사하는 유전자 제어 및 임상 적 플랫폼을 제공합니다. 게놈 편집을 위해 특정 사이트 클레아 제를 (보장 번호)를 사용함으로써, 다른 동종 설정에서 특정 유전자 변경을 품고 새로운 hPSC 라인의 빠른 도출이 가능해진다. 아연 손가락 클레아 제 (ZFNs), 전사 활성제와 같은 이펙터 클레아 제 (TALENs) 및 클러스터 정기적으로 interspaced 짧은 회문 반복 (CRISPR)은 / Cas9은 가장 일반적으로 사용되는 보장 번호입니다. 이러한 뉴 클레아의 모든함으로써 게놈 현장에서 정확한 유전자 편집을 촉진, 특정 사이트에서 이중 가닥 DNA 휴식을 도입하여 작동합니다. SSN-묵상 게놈 편집 삽입 / 삭제 돌연변이 또는 Alt를 도입하거나 세포의 내생 DNA 회복 메커니즘, 비 동종 끝 (NHEJ)에 가입하고 상동 감독 수리의 두 (HDR)를 활용이중 가닥 휴식의 사이트에있는 상동 수리 템플릿을 사용하여 게놈 어. hPSCs의 전기는 형광등 기자들과 항생제 내성 카세트로 유전자를 통합 보장 번호 및 수리 템플릿을 형질의 효율적인 수단이다. 전기 천공 후에, 항생제 내성을 선택하여 수리 구조체를 혼입 hPSCs들만을 분리하는 것이 가능하다. 기계적 hPSC 콜로니를 분리하고 유전자형을 통해 목표 부위에 적절한 통합을 확인 올바르게 표적 유전자와 동종 세포주의 격리를 허용한다. 이 프로토콜의 유효성은 EGFP 및 퓨로 마이신 저항이 인간 다 능성 줄기 세포의 AAVS1 면책 궤적으로 구성 통합하는 세 가지 SSN 플랫폼을 사용하여 여기에 설명된다.
게놈 편집 기술은 빠르게 분자 및 세포 생물학 1 표준 도구로 진화하고있다. hPSCs 유전자 그대로 차 인간 세포의 자기 갱신 소스를 나타내는 인간 다 능성 줄기 세포 (hPSCs)의 유전자 조작은 특히 중요하다. hPSCs는 질병 모델링 또는 이식 요법 2,3-위한 소스와 같은 다양한 유형의 세포로 분화 될 수있다. AAVS1의 궤적에서 리포터 구조의 대상으로 통합을위한 내생 DNA 복구 메커니즘과 함께 사이트 별 클레아 제 (보장 번호)의 세 가지 유형을 사용하는 프로토콜은 여기에 설명했다. hPSCs에 보장 번호의 형질 전환 후, 우리는 기자를 숨겨 동종 세포 인구를 분리하는 방법을 보여줍니다.
특히 만능 세포 게놈 줄기, 게놈을 조작 할 수있는 능력은 사용 보장 번호는 징크 핑거 뉴 클레아 제 (ZFNs) 및 전사 activat의 유틸리티와 같은 새로운 현상이 아니다유전자 편집 또는 같은 이펙터 클레아 제 (TALENs)는 몇 년 전 4-10 증명되었다. 그러나, S. pyogenes의의 CRISPR의 출현 / Cas9 기술을 11-13로, 유전자 편집 (14)가 널리 접근이되고있다. 모든 보장 번호가 아닌 동종 최종 합류 (NHEJ)를하거나 상동 감독 수리 (HDR) (15)를 사용하여 내인성 세포 메커니즘에 의해 수리 지정된 대상 사이트 1,4,5,11에서 이중 가닥 DNA 휴식 (DSB)를 소개합니다. NHEJ는 오류가 발생하기 쉬운 것이다 및 신규 요소 SSN과 수리 주형의 공동 형질 감염을 통해 도입 될 수 있도록 허용하면서 HDR, 유전자 기능의 상실을 초래 프레임 시프트 돌연변이를 도입 할 수있다. 유전자 편집을 용이하게 DNA 복구의 기본 원리는 각 SSN위한 대체로 동일하다고 생각되지만, 플랫폼 간의 몇 가지 차이점을 알 수있다. 드 ZFNs의 노보 설계 유연성과 클레아 최적화 16 공개의 그러나 사용을 허용개인 ZFNs을 설계 할 수 어셈블리 라이브러리 및 검사 도구는 시간이 소요될 수 있습니다. ZFN 매개 타겟팅 원하는 궤적이 결정되면, ZFN 쌍은 온라인 ZiFit 공구 (17)로 설계 될 수있다. 디자인 후, ZFNs는 모듈 식으로 플라스미드 복제 (18)의 여러 라운드를 통해 조립 될 수있다. 또한, 많은 상업적으로 이용 가능한, 사전 검증 ZFNs (19)이있다. 이야기 클레아 제는 온라인 도구와 공개적으로 사용 가능한 구성 요소 17, 20를 사용하여 설계 할 수있다. 예를 들어, TALENs 빠르게 플래시 어셈블리 (21) 또는 PCR 기반의 계층 적 골든 게이트 어셈블리 (22)를 사용을 통해, 다섯 이야기 반복 블록에서 조립 될 수있다. SSN 설계 및 CRISPR / Cas9를 사용하여 건축 속도의 용이성 널리 접근 도구를 편집 게놈을 만들었습니다. 가이드의 RNA의 다중화는 단일 구조 (14) 여러 궤적을 대상으로하는 CRISPR의 짧은 가이드 RNA 매개 타겟팅 / Cas9도 있습니다. 디자인대상 궤적에 인접 유전자 편집을위한 Cas9의 protospacer 인접 모티브 (S. 대한 NGG의 trinucleotide가 Cas9를 pyrogenes PAM)의 확인이 필요합니다. px330 플라스미드 14으로 PAM의 20 염기쌍 (5 ')에 상응하는 올리고 뉴클레오티드를 삽입하여, 구조체는 하나의 복제 단계에서 조립 될 수있다. S. 이외에 오게 네스 Cas9, N.에서 Cas9 NNNNGATT-5'-3 '(PAM)를 인식 뇌수막염 (NmCas9)는 hPSCs 23 효율적인 유전자 편집을 허용하는 것으로 나타났다.
SSN 설계의 용이성의 차이뿐만 아니라, 각각의 플랫폼은 특정 속성을 갖는다. 예를 들어, ZFNs 및 TALENs Cas9은 주로 생성 종단 DSBs을 무디게 생각하면서 네 뉴클레오티드 5 '오버행 (24)를 생성 FokI 클레아 도메인을 이용한다. ZFNs, TALENs 및 Cas9는 온 – 오프 비율 표적 DNA에 자신의 단백질 안정성에 차이가, 그리고 DNA 검사의 모드 모두 C의이론적으로 편집 한 결과의 작은 차이가 발생 울드. 추가 연구가 완전히 이러한 차이의 결과를 이해하도록 요구 될 것이지만, 여기 세 플랫폼 매우 견고하고 용이 hPSCs 유전자 변형을 생성하기 위해 사용될 수있다 프로토콜을 설명한다.
에 관계없이 SSN 선택의, 전기는 hPSCs (25)에있는 SSN과 동성 수리 템플릿을 형질하는 강력한 절차입니다. 항생제 내성에 대한 선택 후 식민지를 생존의 수는 궤적 특정 매개 변수 및 편집 전략 (유전자 삽입과 선택 모드의 예를 들면, 크기)에 따라 달라집니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 일반적으로 약 150-400 단세포 유래 콜로니를 초래한다.
유전자 편집이 프로토콜을 이용하여 AAVS1 유전자좌 이전 보장 번호 4,5의 효과를 보여주기 위해 사용되었다. AAV-CAGGS-EGFP 수리 템플릿은 유전자 트랩 STR을 사용ategy는 궤적 특정 방식으로 퓨로 마이신 내성을 부여합니다. 간단히, 수리 템플릿은 promoterless의 퓨로 마이신 저항 카세트의 상류 스플 라이스 수용체 사이트가 포함되어 있습니다. AAVS1 유전자좌 PPP1R12C 유전자의 첫번째 인트론에 올바르게 통합하면, 저항 카세트 편집 유전자의 프로모터로부터 발현된다. 이 특정 AAVS1 분석의 견고 함은 우리가 각각의 SSN 플랫폼의 효율성을 비교할 수 있습니다.
보장 번호를 이용하여 유전자 편집 방해 및 / 또는 이론적으로 어떤 유전자를 변경하는 기능이 주어진 강력하다. hPSCs이 전략을 적용하는 단계가 후속 hPSCs 이러한 뉴런 26 인간 세포 유형의 다수로 분화 할 수 있기 때문에, 범용성을 제공한다 (27) 간세포, 심근 세포와 28. 또한, 환자 유래 유도 다 능성 줄기 세포의 사용은 환자의 특정 유전 배경 (29)에서 공지의 보수 또는 질병을 유발하는 돌연변이의 도입을 허용 </sup>, 질병 메커니즘과 환자 자신의 세포 (30)를 사용하여 테스트 치료제를 조사에서 플랫폼을 제공한다. 요약하면, hPSCs에서 유전자 편집 인간 발달과 질병 (31)의 기본적인 생물학을 조사하기위한 효율적이고 다양한 접근 방법이다.
유전자 편집 인간 다 능성 줄기 세포의 동종 집단을 분리 여기 제시된 방법은 표적 유전자좌 만 다른 동종 hPSC 라인을 생성하기위한 강력한 방법이다. 이러한 세포는 인간 세포의 분화 및 발달을 프로빙 메커니즘뿐만 아니라 제어 유전 설정에서 단일 유전자 질환의 병태 생리에 대한 이해를위한 이상적인 시스템이다. 여기에서 입증 된 바와 같이, 그 궤적 AAVS1 대상으로 통합을 달성하기 위해 3 개의 독립적 인 SSN 설계 전략 (ZFNs, TALENs 및 CRISPR / Cas9)를 사용하는 것이 가능하다. 이 방법은 각각 자신의 장점과 단점이 있습니다. 전위 ZFNs 이용하고, 어느 정도, TALENs 개별 클레아 (42)의 결합 도메인 DNA를 향상시키기 위해 공학 반복있게 설계 유연성이다. 이 클레아 최적화는 CRI와 달성 것 이상의 ZFNs 및 TALENs의 특이성을 증가시킬 수SPR / Cas9 시스템. 이러한 선택성은 표적 특이성이 요구되는 높은 수준의 임상 적 응용에 중요 할 수있다. CRISPR / Cas9 시스템의 주요 장점은 사용의 용이함이다. TALEN과 ZFN 건설 키트 (Addgene (21)를 통해 예) 공중에 이용 가능하게되었지만, 단지 필요한 커스터마이즈 20 염기쌍 올리고 그대로 px330 플라스미드를 사용하는 경우, CRISPR / Cas9 기반 보장 번호는 (구성하는 것이 훨씬 쉽다 디자인 14). 이 간단하게 자신의 연구에서 게놈 편집을 포함하고자하는 연구소에 대한 유리한 것으로 증명한다.
유전자 편집 hPSC 라인을 만드는 nucleofection 43 포함한 다른 형질 전환 방법이있다; 그러나 전기는 일관되고 비용 효율적인 4,5,25 것으로 나타났다. Nucleofection는 SSN 효율을 증가 직접 핵 내로 Cas9 가이드 RNA의 리보 착체를 형질하는데 사용될 수있다D 충실도 (44). MEFs에에 hPSCs 성장 과도한 차별없이 만능 상태에서 hPSCs을 유지하기 위해 강력하고 저렴한 방법입니다. 또한, 유 전적으로 동일한 콜로니 쉽게 분리 가능하다. 대안 적으로, 그러나 이러한 배양 조건은 배양 물 공급 계보다 더 비쌀 수 MEFs에 hPSCs없이 배양 할 수있다. 또한, 전체 프로세스는 매우 드문 편집 이벤트 단리 또는 편집 평행 실험에서 많은 별개 세포주의 생성을 가능하게 확장된다.
여기에 설명 된 프로토콜이 강력; 그러나 정확하게 편집 클론을 얻을 수있는 효율에 영향을주는 여러 가지 주요 단계가있다. 이 방법의 가장 중요한 구성 요소는 높은 품질의 MEFs에 약물 내성 DR4의 MEFs에 데있다. 단일 hPSCs의 생존 얇은이며, 저품질 MEFs에 미분화 hPSC 라인들의 분리를 방해한다. 둘째로, Y-27632의 사용은 또한이상 핵형 45 세포 선택적 압력을 생성하지 않고 단일 세포 생존을 허용하는 키. 셋째, 잘 간격 식민지를 따기 유래 세포 라인의 유전 적 동질성을 보장합니다. 마지막으로, 개구부가 많은 작은 조각으로 콜로니를 파괴하기에 충분히 작도록 다수의 콜로니를 새로운 잘 성장할 것이라는 보장 유리 피펫을 준비하는 것이 중요하다. 복제 판은 유전자형에 대한 격리 식민지의 원판을 떠나 문화가하려면이 잘 간격 서브 클론의 수확을 허용합니다. 이 프로토콜에 도전 부분은 유리 피펫으로 당겨 수동이다 이것은 사전에 연습을해야한다. 이는 유리 피펫을 필요로하지 않는 클론 피킹 여러 기술들이 있다는 것을 유의해야한다. 실험자들은 그들에게 가장 적합한 하나를 찾을 것을 권장합니다.
간단한 개조로 극복 할 수있다이 프로토콜에 제한이 있습니다. O를위한 실험할수 있답니다 그 수리 템플릿 선택 카세트를 포함하지 않는, 편집 한 세포 농축의 다른 방법을 사용해야합니다 수리 또는 하나없이 관심의 궤적을 방해. 양성 클론을 찾기 위해 고른해야 콜로니의 수는 선택의 부재시 크게 증가합니다. 효율성을 개선하기위한 한 가지 전략은 형광 단백질을 발현하는 비 – 통합 된 플라스미드를 공동 형질 감염이다. 세포 이틀간 회복시킨 후, 표적 세포는 형광 활성화 세포 정렬을 사용하여 긍정적 인 형광에 정렬 및 29 플레이 팅 될 수있다. 이 프로세스는 전기 천공에 의해 플라스미드로 형질 감염되어 세포 풍부하여 셀의 동시 편집 이벤트의 가능성을 증가시킨다.
여기에 설명 된 기술들은 동시에 여러 궤적 14,46,47 타겟팅 여러 가이드의 RNA를 사용하여 확장 될 수있다. 대부분의 프로토콜은 hPSCs을 차별화하기 위해 설립 된독특한 세포 유형으로, 관심의 30 종류의 세포에 각종 유전자 조작을 허용한다. 전반적으로, 우리는 관계없이 SSN 선택의 hPSCs 효율적인 게놈 편집의 가능성을 증명하고있다. 우리는이 기술은 임의의 게놈 유전자좌 유전자 편집 된 동종 hPSC 라인을 생성하도록 구성 될 수 있다는 것을 제안한다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 헬렌 Bateup에 뇌 연구 재단의 씨 그랜트 (BRFSG-2014-02)에 의해 지원되었다. 더크 Hockemeyer는 엘리슨 의료 재단의 노화에 새 학자와 글렌 재단뿐만 아니라 Shurl와 케이 쿠 르치 재단이 지원됩니다. DH는 NIH 보조금 1R01CA196884-01에 의해 지원됩니다.
DMEM/F12 | Life Technologies | 11320082 | |
Fetal Bovine Serum (HI) | Life Technologies | 10082-147 | |
Knockout Serum | Life Technologies | 10828-028 | |
Fibroblast Growth Factor – basic | Life Technologies | PHG0261 | |
Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 | |
Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
MEM NEAA | Life Technologies | 11140-050 | |
2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
Y-27632 | Calbiochem | 688000 | |
6-well plates | Corning | 3506 | |
12-well plates | Corning | 3512 | |
4mm Electroporation cuvettes | Bio-rad | 165-2081 | |
X-cel gene pulser II | Bio-rad | 165-2661 | |
0.25 % Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-056 | |
10× Phosphate buffered saline (PBS) pH7.4 | Life Technologies | 70011-044 | |
Puromycin | Life Technologies | A11138-02 | |
Pasteur pipettes, plugged | VWR | 14672-412 | |
Tris-HCl | Sigma-Aldrich | S5941 | |
NaCL | Sigma-Aldrich | S9888 | |
SDS | Sigma-Aldrich | L3771 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
Proteinase-K | Life Technologies | AM2544 | |
Ethanol | VWR | TX89125-172SFU | |
Isopropyl Alcohol | VWR | MK303216 | |
TE Buffer | Life Technologies | 12090-015 | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
1.8 ml Cryotubes | ThermoScientific | 377267 |