I meccanismi che regolano la motilità interstiziale di cellule CD4 T effettrici in siti di infiammazione sono relativamente sconosciuti. Presentiamo un approccio non invasivo per visualizzare e manipolare cellule CD4 T vitro -primed nel derma dell'orecchio infiammate, permettendo studio del comportamento dinamico di queste cellule in situ.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Imaging CD4 T cellule interstiziali migrazione nel derma infiammate
In questo articolo
Sommario
Abstract
La capacità delle cellule T CD4 per svolgere funzioni effettrici dipende dalla migrazione rapida ed efficiente di queste cellule in tessuti periferici infiammati attraverso un meccanismo non ancora definito. L'applicazione della microscopia multiphoton allo studio del sistema immunitario fornisce uno strumento per misurare la dinamica delle risposte immunitarie all'interno tessuti intatti. Qui vi presentiamo un protocollo per l'imaging non invasivo intravitale multifotonica delle cellule T CD4 nel derma per le orecchie del mouse infiammate. Uso di una piattaforma di imaging personalizzato e un catetere venoso permette la visualizzazione delle dinamiche di cellule CD4 T nell'interstizio dermico, con la possibilità di interrogare queste cellule in tempo reale mediante l'aggiunta di anticorpi bloccanti di componenti molecolari coinvolti nella motilità. Questo sistema fornisce vantaggi rispetto ai due modelli in vitro e procedure di imaging invasivi di tipo chirurgico. La comprensione dei percorsi utilizzati dalle cellule T CD4 per la motilità può infine fornire una conoscenza delle basifunzione c di cellule CD4 T e patogenesi di entrambe le malattie autoimmuni e patologia da infezioni croniche.
Introduzione
La funzione effettrice delle cellule T CD4 dipende in modo critico dalla loro capacità di entrare e attraversare rapidamente un'ampia varietà di tessuti periferici per rilevare danni, localizzare focolai di infezione o causare patologie da infezione cronica o autoimmunità. Mentre i processi di homing ai sitiinfiammati 1-4 e di stravaso5-7 dalla vascolarizzazione nei tessuti sono stati ben caratterizzati, i fattori che guidano e regolano la motilità interstiziale delle cellule T rimangono indefiniti. La migrazione di cellule T in ambienti 3D complessi è stata studiata in vitro attraverso l'uso di matrici artificiali8-10 o disp....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Tutte le procedure che coinvolgono i topi sono stati approvati dal Comitato Cura e uso istituzionale degli animali dell'Università di Rochester, e condotte in stretta conformità con la legge sulla protezione degli animali e la politica Public Health Service su Humane cura e l'uso di animali da laboratorio amministrato dal National Institutes della Salute, Ufficio di laboratorio Animal Welfare.
1. Preparazione di cellule effettrici T CD4
NOTA: BALB / c topi DO11.10 TCR-transgenici che riconoscono specificamente un peptide da ovalbumina uovo di gallina (POVA: ISQAVHAAHAEINEAGR). Altri sistemi di TCR-transg....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
La possibilità di studiare le risposte immunitarie in loco senza alterare l'ambiente immunitario è essenziale per lo studio delle interazioni in tempo reale delle cellule T effettrici con un tessuto infiammato. Imaging del derma orecchie intatte di questo protocollo, descritto nella Figura 1A e B, permette la visualizzazione di trasferire cellule T effettrici fluorescente nell'interstizio cutanea. Questo permette sia ad alta risoluzione .......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Importanza
Qui vi presentiamo un protocollo completo per la visualizzazione 4D di, antigene-specifica effettrici cellule Th1 trasferiti nel derma per le orecchie del mouse intatti. Questo metodo fornisce vantaggi rispetto alcune modalità di imaging correnti per diversi motivi. Con l'imaging del derma orecchie ventrali, siamo in grado di rinunciare depilazione che è necessario per i protocolli di imaging che coinvolgono altri siti cutanei. Anche se per la depilazione sono general.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano l'Università di Rochester struttura Multiphoton Microscopio Nucleo per un aiuto con immagini dal vivo. Supportato da NIH AI072690 e AI02851 a DJF; AI114036 di AG e AI089079 di MGO.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Topi BALB/c | Jackson Laboratories | 000651 | I topi utilizzati sono stati allevati internamente |
| DO11.10 topi | Jackson Laboratories | 003303 | I topi utilizzati sono stati allevati internamente |
| HBSS | Fisher | 10-013-CV | equivalente multiplo |
| (NCS) | Thermo/HyClone | SH30118.03 | Calore inattivato a 56 ° C per 30 minuti |
| Complemento di cavia | Cedarlane | CL-5000 | |
| anticorpo anti-CD8 | ATCC | 3.155 (ATCC TIB-211) | Anticorpi derivati da questo ibridoma |
| anti-MHC Classe II anticorpo | ATCC | M5/114.15.2 (ATCC TIB-120) | Anticorpi derivati da questo ibridoma |
| anti-CD24 anticorpo | ATCC | J11d.2 (ATCC TIB-183) | Anticorpi derivati da questo ibridoma |
| anticorpo Thy1.2 | ATCC | J1j.10 (ATCC TIB-184) | Anticorpi derivati da questo ibridoma |
| Ficoll (Fico/Lite-LM) | Atlanta Biologicals | I40650 | |
| PBS | Fisher | 21-040-CV | EDTA multiplo |
| equivalente | Fisher | 15323591 | |
| anticorpo biotinilato anti-CD62L (clone MEL-14) | BD | ||
| streptavidina perline di separazione magnetica | Miltenyi | 130-048-101 | |
| MACS LS Colonna di separazione | Miltenyi | 130-042-401 | |
| umano ricombinante IL-2 | Peprotech | 200-02 | |
| topo ricombinante IL-4 | Peprotech | 214-14 | |
| topo ricombinante IL-12 | Peprotech | 210-12 | |
| anticorpo anti-IFNg (clone XMG 1.2) | eBioscience | 16-7311-85 | |
| anticorpo anti-IL-4 (clone 11b11) | eBioscience | 16-7041-85 | |
| RPMI | VWR | 45000-412 | |
| Penicillina/Streptomicina | Fisher | 15303641 | |
| L-glutammina | Fisher | 15323671 | |
| 2-mercaptoetanolo | Bio-Rad | 161-0710 | |
| peptide di ovoalbumina | Biopeptide | ISQAVHAAHAEINEAGR-OH peptide | |
| Fetale di Vitello (FCS) | Thermo/HyClone | SV30014.03 | Calore inattivato a 56 ° C per 30 minuti Piastra di |
| coltura a 24 pozzetti | LPS | 3526 | CFSE Life Technologies multiplo equivalente |
| C34554 | |||
| CMTMR | Life Technologies | C2927 | |
| 28 siringhe da insulina G1/2, 1ml | BD | 329420 | |
| 28 siringhe da insulina G1/2, 300μ l | BD | 309301 | |
| 27 siringhe G1/2 TB, 1 ml | BD | 309623 | |
| 30 aghi G1/2 BD | 305106 | ||
| Tubo medico PE-10 | BD | 427400 | |
| cianoacrilato adesivo veterinario (Vetbond) | 3M | 1469SB | |
| piastra riscaldante | WPI | 61830 | |
| Regolatore piastra riscaldante | WPI | ATC-2000 | |
| Controller per coperta d'acqua | Gaymar | TP500 | Non più in produzione, nuovo equivalente equivalente disponibile |
| per coperta d'acqua | Kent Scientific | TP3E | |
| Vaporizzatore di isoflurano | LEI Medical | Isotec 4 | Non più in produzione, nuovo equivalente equivalente disponibile |
| Henry Schein | Ordinato tramite veterinario provette | ||
| per microcentrifuga | VWR | 20170-038 | Nastro medico multiplo equivalente |
| 3M | 1538-0 | ||
| Nasello | Costruito internamente, vedere Fig 2 | ||
| piattaforma | Costruito internamente, vedere Fig 2 | ||
| pinza curva | WPI | 15915-G | Forbici equivalenti multiple |
| Roboz | RS-6802 | Vetrini coprioggetti equivalenti multipli | |
| VWR | |||
| Grasso per alto vuoto | Fisher | 146355D | |
| per attività delicate | Fisher | 34155 | |
| Microscopio verticale Olympus Fluoview 1000 AOM-MPM equivalente multiplo con fisica spettrale MaiTai HP DeepSee Ti:Sa laser | Olympus | call for quote | |
| tavolo ottico con controllo delle vibrazioni | Newport | call for quote | |
| 25x NA 1.05 obiettivo a immersione in acqua per imaging multifotone | Olympus | XLPLN25XWMP2 | |
| riscaldatore dell'obiettivo | Bioptechs | PN 150815 | |
| Cubo filtro di rilevamento | Olympus | FV10-MRVGR/XR | Cubo proprietario, può essere approssimato da singoli filtri/dicroici |
| anti-integrina e beta; 1 anticorpo (clone hMb1-1) | eBioscience | 16-0291-85 | Senza azide, a basso contenuto di endotossine |
| anti-integrina e beta; 3 (clone 2C9. G3) | eBioscience | 16-0611-82 | senza azidi, a basso contenuto di endotossine |
| (70.000 MW) | Life Technologies | D-1830 |
Riferimenti
- Denucci, C. C., Mitchell, J. S., Shimizu, Y. Integrin function in T-cell homing to lymphoid and nonlymphoid sites: getting there and staying there. Critical reviews in immunology. 29 (2), 87-109 (2009).
- Gehad, A., et al.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
