SiRNA की मध्यस्थता मुंह बंद करके माउस oocytes में meiotic तकला आकलन
Summary
यहाँ, हम माउस oocytes में अर्धसूत्रीविभाजनिक धुरी विधानसभा और संगठन का मूल्यांकन करने के इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण के बाद विशिष्ट siRNA की मध्यस्थता mRNA कमी के लिए एक प्रोटोकॉल उपस्थित थे। इस प्रोटोकॉल के टेप की इन विट्रो कमी और विभिन्न धुरी और / या oocytes में MTOC जुड़े कारकों के कार्यात्मक मूल्यांकन के लिए उपयुक्त है।
Abstract
Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon fertilization. The resulting aneuploidy in developing embryos is recognized as a major cause of pregnancy loss and congenital birth defects such as Down’s syndrome. Accurate chromosome segregation is critically dependent on the formation of the microtubule spindle apparatus, yet this process remains poorly understood in mammalian oocytes. Intriguingly, meiotic spindle assembly differs from mitosis and is regulated, at least in part, by unique microtubule organizing centers (MTOCs). Assessment of MTOC-associated proteins can provide valuable insight into the regulatory mechanisms that govern meiotic spindle formation and organization. Here, we describe methods to isolate mouse oocytes and deplete MTOC-associated proteins using a siRNA-mediated approach to test function. In addition, we describe oocyte fixation and immunofluorescence analysis conditions to evaluate meiotic spindle formation and organization.
Introduction
अर्धसूत्रीविभाजन युग्मक (oocytes और शुक्राणु) में होता है और अर्धसूत्रीविभाजन I और अर्धसूत्रीविभाजन II, क्रमश: 1 के दौरान मुताबिक़ क्रोमोसोम और बहन क्रोमेटिडों को अलग करने के लिए डीएनए संश्लेषण हस्तक्षेप के बिना लगातार दो डिवीजनों शामिल है कि एक अद्वितीय विभाजन की प्रक्रिया है। Oocytes में अर्धसूत्रीविभाजनिक विभाजन के दौरान गुणसूत्र अलगाव में त्रुटियाँ निषेचन के दौरान भ्रूण से विरासत में मिली है जो aneuploidy, हो सकती है। उल्लेखनीय है कि विकासशील भ्रूण में aneuploidy की घटनाओं को मातृ उम्र में आगे बढ़ने के साथ बढ़ जाती है और महिलाओं 1,2 में गर्भावस्था के नुकसान के रूप में के रूप में अच्छी तरह से जन्मजात जन्म दोष का एक प्रमुख कारण है, इस प्रकार, अर्धसूत्रीविभाजनिक विभाजन के दौरान aneuploidy के आणविक आधार को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण आवश्यकता को रेखांकित ।
कोशिका विभाजन के दौरान, गुणसूत्र अलगाव विपरीत धुरी करने के लिए सही कुर्की के लिए सूक्ष्मनलिका धुरी तंत्र और स्थिर गुणसूत्र-सूक्ष्मनलिका बातचीत की स्थापना का विधानसभा पर महत्वपूर्ण निर्भर हैडंडे। महत्वपूर्ण बात है, स्तनधारी oocytes में अर्धसूत्रीविभाजनिक धुरी गठन दैहिक कोशिकाओं में बँटवारा से अलग है, और अद्वितीय सूक्ष्मनलिका आयोजन केन्द्रों centrioles 3,4 कमी है कि (MTOCs) द्वारा नियंत्रित किया जाता है। सूक्ष्मनलिका न्यूक्लिएशन और संगठन के लिए आवश्यक आवश्यक प्रोटीन सूक्ष्मनलिका विधानसभा उत्प्रेरित कि γ ट्यूबिलिन सहित डिम्बाणुजनकोशिका MTOCs, करने के लिए स्थानीय बनाना। इसके अलावा, MTOCs 5 में बांधता है जो एक आवश्यक मचान प्रोटीन, के रूप में कार्य करता है और एंकर γ ट्यूबिलिन के साथ ही अन्य कारकों pericentrin। विशेष रूप से, हमारे अध्ययन कुंजी MTOC जुड़े प्रोटीन की कमी अर्धसूत्रीविभाजनिक धुरी संगठन बाधित और पूरी तरह से धुरी विधानसभा चेकपॉइंट (सैक) 6.7 द्वारा हल नहीं कर रहे हैं, जो oocytes में गुणसूत्र अलगाव त्रुटियों की ओर जाता है कि प्रदर्शित करता है। इसलिए, अर्धसूत्रीविभाजनिक गिरफ्तारी को ट्रिगर नहीं है कि धुरी स्थिरता में दोष, aneuploidy में योगदान करने में एक महत्वपूर्ण जोखिम मुद्रा। धुरी विधानसभा और संगठन, डिम्बाणुजनकोशिका MTOC prot में उनकी महत्वपूर्ण भूमिका के बावजूदein संरचना और समारोह समझ खराब रहता है।
कोशिकाओं शीघ्र ही अर्धसूत्रीविभाजन 8,9 की बहाली से पहले transcriptionally मौन हो के रूप में स्तनधारी oocytes में विशिष्ट लक्ष्य प्रोटीन के समारोह परीक्षण, चुनौती दे रहा है। इसलिए, पूर्व ovulatory oocytes अर्धसूत्रीविभाजन को फिर से शुरू करने के लिए मातृ mRNA दुकानों पर भरोसा करते हैं और अर्धसूत्रीविभाजनिक विभाजन के रूप में अच्छी तरह से निषेचन 10,11 के बाद पहली दरार डिवीजनों समर्थन करते हैं। स्तनधारी oocytes में mRNA टेप की शाही सेना हस्तक्षेप (आरएनएआई) मध्यस्थता गिरावट की प्रभावकारिता अच्छी तरह से स्थापित है और अर्धसूत्रीविभाजनिक परिपक्वता के दौरान अनुवाद के लिए भर्ती मातृ आरएनए siRNA 12-14 को लक्षित करने के लिए विशेष रूप से उत्तरदायी हैं। इसलिए, oocytes में कम दखल RNAs के microinjection (siRNAs) कार्यात्मक परीक्षण के लिए लक्ष्य mRNAs गिरेगा के लिए एक मूल्यवान दृष्टिकोण प्रदान करता है।
यहाँ, हम माउस oocytes और विशिष्ट transcri की siRNA की मध्यस्थता कमी के अलगाव के लिए विधियों का वर्णनअंक pericentrin, एक आवश्यक MTOC जुड़े प्रोटीन के समारोह का परीक्षण करने के लिए। इसके अलावा, हम oocytes में अर्धसूत्रीविभाजनिक धुरी गठन का मूल्यांकन करने के immunofluorescence विश्लेषण की स्थिति का वर्णन है।
Protocol
Representative Results
Discussion
ऐसे electroporation और अभिकर्मक के रूप में दैहिक कोशिकाओं में बहिर्जात न्यूक्लिक एसिड हस्तांतरण के लिए कई तरीके हैं, वहीं microinjection transcriptionally मौन माउस oocytes में आरएनए अणुओं के वितरण के लिए इष्टतम तरीका है। मौजूदा प्रोटोक…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported in part by the University of Georgia, and a grant (HD071330) from the National Institutes of Health to MMV.
Materials
| Reagents | |||
| Pregnant Mare's Serum Gonadotropin (PMSG) | EMD Biosciences | 367222 | |
| Minimal Essential Medium (MEM) | *Recipe outlined in Table 1 | ||
| Earle's Balanced Salt Solution (10x) | Sigma | E-7510 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S-5761 | |
| Pyruvic Acid, sodium salt | Sigma | P-5280 | |
| Penicillin G, potassium salt | Sigma | P-7794 | |
| Streptomycin Sulfate | Sigma | S-9137 | |
| L-Glutamine | Sigma | G-8540 | |
| EDTA, disodium salt dihydrate | Sigma | E-4884 | |
| Essential Amino Acids (50x) | Gibco | 11130-051 | |
| MEM Vitamin Mixture (100x) | Sigma | M-6895 | |
| Phenol Red solution | Sigma | P-0290 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A1470 | |
| Milrinone | Sigma | M4659 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30070.01 | |
| EmbryoMax M2 Media with Hepes | EMD Millipore | MR-015-D | |
| siRNAs targeting Pericentrin | Qiagen | GS18541 | |
| Negative control siRNAs | Qiagen | SI03650318 | |
| Paraformaldehyde (16% solution) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton-X | Sigma | T-8787 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Hyclone | SH30028.02 | |
| Anti-Pericentrin (rabbit) | Covance | PRB-432C | |
| Anti-acetylated a-tubulin (mouse) | Sigma | T-6793 | |
| Goat anti-rabbbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21430 | |
| Goat anti -mouse Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-11017 | |
| Major Equipment | |||
| Stereomicroscope (SMZ 800) | Nikon | ||
| Upright Fluorescent Microscope | Leica Microsystems | ||
| Inverted Microscope | Nikon | ||
| Femtojet Micro-injections System | Eppenforf | ||
| Micro manipulators | Eppendorf | ||
| Micro-injection needles (femtotips) | Eppendorf | 930000035 | |
| Holding pipettes (VacuTip) | Eppendorf | 930001015 | |
| Plasticware | |||
| 35mm culture dishes | Corning Life Sciences | 351008 | |
| 4-well plates | Thermo Scientific | 176740 | |
| 96 well plates | Corning Life Sciences | 3367 | |
| 0.45 mm CA Filter System | Corning Life Sciences | 430768 |
Riferimenti
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