Meiotic mandrino valutazione in mouse Ovociti mettendo a tacere siRNA-mediata
Summary
Qui, vi presentiamo un protocollo per le specifiche esaurimento mRNA siRNA-mediata seguita da analisi di immunofluorescenza per valutare il montaggio fuso meiotico e l'organizzazione in ovociti di topo. Questo protocollo è adatto a deplezione di trascritti in vitro e valutazione funzionale diverso mandrino e / o fattori MTOC associati in oociti.
Abstract
Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon fertilization. The resulting aneuploidy in developing embryos is recognized as a major cause of pregnancy loss and congenital birth defects such as Down’s syndrome. Accurate chromosome segregation is critically dependent on the formation of the microtubule spindle apparatus, yet this process remains poorly understood in mammalian oocytes. Intriguingly, meiotic spindle assembly differs from mitosis and is regulated, at least in part, by unique microtubule organizing centers (MTOCs). Assessment of MTOC-associated proteins can provide valuable insight into the regulatory mechanisms that govern meiotic spindle formation and organization. Here, we describe methods to isolate mouse oocytes and deplete MTOC-associated proteins using a siRNA-mediated approach to test function. In addition, we describe oocyte fixation and immunofluorescence analysis conditions to evaluate meiotic spindle formation and organization.
Introduction
La meiosi è un processo di divisione unica che si verifica in gameti (ovociti e spermatozoi) e coinvolge due divisioni successive senza intervenire sintesi del DNA per separare i cromosomi omologhi e cromatidi fratelli durante la meiosi I e meiosi II, rispettivamente, 1. Errori nella segregazione dei cromosomi durante la divisione meiotica in oociti possono causare aneuploidia, che viene ereditato dalla embrione durante la fecondazione. In particolare, l'incidenza di aneuploidie negli embrioni in via di sviluppo aumenta con l'avanzare dell'età materna, ed è una delle principali cause di difetti di nascita congeniti così come la perdita di gravidanza nelle donne 1,2, quindi, sottolineando l'importante necessità di comprendere le basi molecolari di aneuploidie durante la divisione meiotica .
Durante la divisione cellulare, la segregazione dei cromosomi è strettamente dipendente dalla assemblea degli apparati microtubuli fuso e la creazione di interazioni stabili cromosomiche-microtubuli per un corretto attaccamento al mandrino oppostopali. È importante sottolineare che la formazione del fuso meiotico in ovociti di mammiferi si differenzia da mitosi nelle cellule somatiche, ed è regolata da centri-microtubuli organizzare unici (MTOC) che mancano centrioli 3,4. Proteine essenziali necessari per microtubuli nucleazione e di organizzazione localizzano a MTOC ovociti, tra cui γ-tubulina che catalizza dei microtubuli. Inoltre, pericentrin funziona come una proteina essenziale impalcature, che lega e ancoraggi gamma-tubulina, nonché altri fattori in MTOC 5. In particolare, i nostri studi dimostrano che la deplezione delle proteine MTOC associate chiave interrompe organizzazione fuso meiotico e porta ad errori cromosoma segregazione in ovociti, che non sono completamente risolti con il checkpoint del fuso (SAC) 6,7. Pertanto, difetti di stabilità mandrino, che non attivano l'arresto meiotica, presentano un rischio significativo nel contribuire a aneuploidie. Nonostante il loro ruolo essenziale per il montaggio del mandrino e organizzazione, prot ovociti MTOCcomposizione e la funzione ein rimane poco compresa.
Testare la funzione di specifiche proteine bersaglio negli ovociti di mammiferi è impegnativo, in quanto le cellule diventano trascrizionalmente quiescenza poco prima della ripresa della meiosi 8,9. Quindi, ovociti pre-ovulatori si affidano a negozi mRNA materni per riprendere la meiosi e sostenere divisione meiotica così come le prime divisioni scissione dopo la fecondazione 10,11. L'efficacia di RNA interference (RNAi) la degradazione mediata di trascritti di mRNA negli ovociti di mammiferi è ben consolidata e RNA materni reclutati per la traduzione durante la maturazione meiotica sono particolarmente suscettibili di siRNA targeting per 12-14. Pertanto, la microiniezione di brevi RNA interferenti (siRNA) in ovociti offre un valido approccio per esaurire mRNA bersaglio per i test funzionali.
Qui, descriviamo i metodi per l'isolamento di ovociti di topo e di siRNA mediata esaurimento delle transcri specificopts per testare la funzione di una proteina essenziale MTOC-associata, pericentrin. Inoltre, si descrivono le condizioni di analisi di immunofluorescenza per valutare la formazione del fuso meiotico in ovociti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mentre ci sono diversi metodi per esogena trasferimento di acidi nucleici nelle cellule somatiche, come elettroporazione e transfezione, microiniezione è il metodo ottimale per la consegna di molecole di RNA in ovociti trascrizionalmente quiescenti del mouse. Il protocollo attuale prevede un approccio efficace per esaurimento in vitro di specifici mRNA che consentono il collaudo funzionale di diverso fuso e / o fattori MTOC associate in ovociti. Questo approccio si traduce in efficienza esaurimento trascrizion…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported in part by the University of Georgia, and a grant (HD071330) from the National Institutes of Health to MMV.
Materials
| Reagents | |||
| Pregnant Mare's Serum Gonadotropin (PMSG) | EMD Biosciences | 367222 | |
| Minimal Essential Medium (MEM) | *Recipe outlined in Table 1 | ||
| Earle's Balanced Salt Solution (10x) | Sigma | E-7510 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S-5761 | |
| Pyruvic Acid, sodium salt | Sigma | P-5280 | |
| Penicillin G, potassium salt | Sigma | P-7794 | |
| Streptomycin Sulfate | Sigma | S-9137 | |
| L-Glutamine | Sigma | G-8540 | |
| EDTA, disodium salt dihydrate | Sigma | E-4884 | |
| Essential Amino Acids (50x) | Gibco | 11130-051 | |
| MEM Vitamin Mixture (100x) | Sigma | M-6895 | |
| Phenol Red solution | Sigma | P-0290 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A1470 | |
| Milrinone | Sigma | M4659 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30070.01 | |
| EmbryoMax M2 Media with Hepes | EMD Millipore | MR-015-D | |
| siRNAs targeting Pericentrin | Qiagen | GS18541 | |
| Negative control siRNAs | Qiagen | SI03650318 | |
| Paraformaldehyde (16% solution) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton-X | Sigma | T-8787 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Hyclone | SH30028.02 | |
| Anti-Pericentrin (rabbit) | Covance | PRB-432C | |
| Anti-acetylated a-tubulin (mouse) | Sigma | T-6793 | |
| Goat anti-rabbbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21430 | |
| Goat anti -mouse Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-11017 | |
| Major Equipment | |||
| Stereomicroscope (SMZ 800) | Nikon | ||
| Upright Fluorescent Microscope | Leica Microsystems | ||
| Inverted Microscope | Nikon | ||
| Femtojet Micro-injections System | Eppenforf | ||
| Micro manipulators | Eppendorf | ||
| Micro-injection needles (femtotips) | Eppendorf | 930000035 | |
| Holding pipettes (VacuTip) | Eppendorf | 930001015 | |
| Plasticware | |||
| 35mm culture dishes | Corning Life Sciences | 351008 | |
| 4-well plates | Thermo Scientific | 176740 | |
| 96 well plates | Corning Life Sciences | 3367 | |
| 0.45 mm CA Filter System | Corning Life Sciences | 430768 |
Riferimenti
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