Мейоза шпинделя оценка в мышь ооцитов по миРНК-обеспечиваемого молчания
Summary
Здесь мы приводим протокол для конкретного миРНК опосредованного мРНК истощения с последующим анализом иммунофлуоресценции оценить мейоза сборку и организацию шпинделя в ооцитах мыши. Этот протокол предназначен для разрушения в пробирке транскриптов и функциональной оценке различного шпинделя и / или ЦОМТ факторов, ассоциированных в ооцитах.
Abstract
Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon fertilization. The resulting aneuploidy in developing embryos is recognized as a major cause of pregnancy loss and congenital birth defects such as Down’s syndrome. Accurate chromosome segregation is critically dependent on the formation of the microtubule spindle apparatus, yet this process remains poorly understood in mammalian oocytes. Intriguingly, meiotic spindle assembly differs from mitosis and is regulated, at least in part, by unique microtubule organizing centers (MTOCs). Assessment of MTOC-associated proteins can provide valuable insight into the regulatory mechanisms that govern meiotic spindle formation and organization. Here, we describe methods to isolate mouse oocytes and deplete MTOC-associated proteins using a siRNA-mediated approach to test function. In addition, we describe oocyte fixation and immunofluorescence analysis conditions to evaluate meiotic spindle formation and organization.
Introduction
Мейоз является уникальным процессом деления, что происходит в гамет (яйцеклеток и сперматозоидов) и включает в себя два последовательных деления, не вмешиваясь синтез ДНК, чтобы отделить гомологичные хромосомы и сестринские хроматиды во время мейоза-I и мейоз-II, соответственно 1. Ошибки в сегрегации хромосом во время деления мейоза ооцитов может привести к анеуплоидии, которые наследуется эмбриона во время оплодотворения. Примечательно, что заболеваемость анеуплоидии в развивающихся эмбрионов увеличивается с продвижения материнского возраста и является основной причиной врожденных врожденных дефектов, а также потери беременности у женщин 1,2, таким образом, подчеркивает важную необходимость, чтобы понять молекулярную основу анеуплоидии во деления мейоза ,
Во время деления клетки, расхождение хромосом в решающей степени зависит от комплектации аппарата микротрубочек веретена и установления стабильных хромосомных из микротрубочек взаимодействий для правильного крепления к противоположной шпинделяполюса. Важно отметить, что формирование мейоза шпинделя в ооцитах млекопитающих отличается от митоза в соматических клетках, и регулируется уникальных микротрубочек организации центров (MTOCs), которые не имеют центриолей 3,4. Основные белки, необходимые для нуклеации микротрубочек и организации локализуются в ооцитов MTOCs, в том числе гамма-тубулина, который катализирует сборку микротрубочек. Кроме того, pericentrin функций, как одного из важнейших строительных лесов белка, который связывает и анкеров гамма-тубулина, а также других факторов на MTOCs 5. Примечательно, наши исследования показывают, что истощение основных ЦОМТ связанных белков нарушает мейоза организации шпинделя и приводит к ошибкам хромосом в ооцитах, которые не в полной мере решены путем сборки веретена контрольно-пропускном пункте (SAC) 6,7. Таким образом, дефекты в шпинделя стабильности, которые не вызывают задержку мейоза, представляют собой значительный риск в содействии анеуплоидии. Несмотря на их существенную роль в сборке и шпинделя организации, ооцитов MTOC протЭйн состав и функции еще недостаточно изучена.
Тестирование функции специфических белков-мишеней в ооцитах млекопитающих является сложной задачей, так как клетки становятся транскрипционно покоя незадолго до возобновления мейоза 8,9. Следовательно, предовуляторного ооциты полагаться на материнской магазинах мРНК возобновить мейоз и поддерживать деления мейоза, а также первых делений дробления после оплодотворения 10,11. Эффективность РНК-интерференции (RNAi), опосредованной деградации мРНК транскриптов в ооцитах млекопитающих хорошо известна и материнской РНК завербованные для перевода во время мейоза созревания особенно поддаются миРНК ориентации 12-14. Таким образом, микроинъекции коротких интерферирующих РНК (миРНК) в ооциты предоставляет ценную подход к истощению целевых мРНК для функционального тестирования.
Здесь мы опишем методы для выделения ооцитов мыши и миРНК опосредованного истощения конкретных transcriPTS, чтобы проверить функцию важного ЦОМТ связанного белка, pericentrin. Кроме того, описаны условия анализа иммунофлуоресцентных оценить мейоза образование шпинделя в ооциты.
Protocol
Representative Results
Discussion
В то время как существует несколько методов экзогенной передачи нуклеиновой кислоты в соматических клетках, таких как электропорация и трансфекции, микроинъекции является оптимальным способом доставки молекул РНК в транскрипционно молчащих ооцитов мыши. Текущий протокол обеспечив?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported in part by the University of Georgia, and a grant (HD071330) from the National Institutes of Health to MMV.
Materials
| Reagents | |||
| Pregnant Mare's Serum Gonadotropin (PMSG) | EMD Biosciences | 367222 | |
| Minimal Essential Medium (MEM) | *Recipe outlined in Table 1 | ||
| Earle's Balanced Salt Solution (10x) | Sigma | E-7510 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S-5761 | |
| Pyruvic Acid, sodium salt | Sigma | P-5280 | |
| Penicillin G, potassium salt | Sigma | P-7794 | |
| Streptomycin Sulfate | Sigma | S-9137 | |
| L-Glutamine | Sigma | G-8540 | |
| EDTA, disodium salt dihydrate | Sigma | E-4884 | |
| Essential Amino Acids (50x) | Gibco | 11130-051 | |
| MEM Vitamin Mixture (100x) | Sigma | M-6895 | |
| Phenol Red solution | Sigma | P-0290 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A1470 | |
| Milrinone | Sigma | M4659 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30070.01 | |
| EmbryoMax M2 Media with Hepes | EMD Millipore | MR-015-D | |
| siRNAs targeting Pericentrin | Qiagen | GS18541 | |
| Negative control siRNAs | Qiagen | SI03650318 | |
| Paraformaldehyde (16% solution) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton-X | Sigma | T-8787 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Hyclone | SH30028.02 | |
| Anti-Pericentrin (rabbit) | Covance | PRB-432C | |
| Anti-acetylated a-tubulin (mouse) | Sigma | T-6793 | |
| Goat anti-rabbbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21430 | |
| Goat anti -mouse Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-11017 | |
| Major Equipment | |||
| Stereomicroscope (SMZ 800) | Nikon | ||
| Upright Fluorescent Microscope | Leica Microsystems | ||
| Inverted Microscope | Nikon | ||
| Femtojet Micro-injections System | Eppenforf | ||
| Micro manipulators | Eppendorf | ||
| Micro-injection needles (femtotips) | Eppendorf | 930000035 | |
| Holding pipettes (VacuTip) | Eppendorf | 930001015 | |
| Plasticware | |||
| 35mm culture dishes | Corning Life Sciences | 351008 | |
| 4-well plates | Thermo Scientific | 176740 | |
| 96 well plates | Corning Life Sciences | 3367 | |
| 0.45 mm CA Filter System | Corning Life Sciences | 430768 |
Riferimenti
- Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nat Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).
- Hassold, T. J., Hunt, P. A. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
- Szollosi, D., Calarco, P., Donahue, R. P. Absence of Centrioles in the First and Second Meiotic Spindles of Mouse Oocytes. J Cell Sci. 11 (2), 521-541 (1972).
- Manandhar, G., Schatten, H., Sutovsky, P. Centrosome Reduction During Gametogenesis and Its Significance. Biol Reprod. 72 (1), 2-13 (2005).
- Zimmerman, W. C., Sillibourne, J., Rosa, J., Doxsey, S. J. Mitosis-specific anchoring of gamma tubulin complexes by pericentrin controls spindle organization and mitotic entry. Mol Biol Cell. 15 (8), 3642-3647 (2004).
- Ma, W., Baumann, C., Viveiros, M. M. NEDD1 is crucial for meiotic spindle stabilty and accurate chromosome segregation in mammalian oocytes. Dev Biol. 339 (439-450), (2010).
- Ma, W., Viveiros, M. M. Depletion of pericentrin in mouse oocytes disrupts microtubule organizing center function and meiotic spindle organization. Mol Reprod Dev. 81 (11), 1019-1029 (2014).
- Bouniol-Baly, C., et al. Differential Transcriptional Activity Associated with Chromatin Configuration in Fully Grown Mouse Germinal Vesicle Oocytes. Biol Reprod. 60 (3), 580-587 (1999).
- De La Fuente, R., Eppig, J. J. Transcriptional Activity of the Mouse Oocyte Genome: Companion Granulosa Cells Modulate Transcription and Chromatin Remodeling. Dev Biol. 229 (1), 224-236 (2001).
- Hodgman, R., Tay, J., Mendez, R., Richter, J. D. CPEB phosphorylation and cytoplasmic polyadenylation are catalyzed by the kinase IAK1/Eg2 in maturing mouse oocytes. Development. 128 (14), 2815-2822 (2001).
- De La Fuente, R. Chromatin modifications in the germinal vesicle (GV) of mammalian oocytes. Dev Biol. 292 (1), 1-12 (2006).
- Wianny, F., Zernicka-Goetz, M. Specific interference with gene function by double-stranded RNA in early mouse development. Nat Cell Biol. , 270-275 (2000).
- Svoboda, P., Stein, P., Hayashi, H., Schultz, R. M. Selective reduction of dormant maternal mRNAs in mouse oocytes by RNA interference. Development. 127 (19), 4147-4156 (2000).
- Svoboda, P. Renaissance of mammalian endogenous RNAi. FEBS Letters. 588 (15), 2550-2556 (1016).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K., Nagy, A. . Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , (2014).
