This protocol describes how to generate a Drosophila S2 cell line that is sensitive to small molecule inhibitors of kinesin-5. The use of these cells in a cell-based error correction assay is also outlined.
Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper distribution of the genetic material requires that sister kinetochores on every chromosome become bioriented by attaching to microtubules from opposite spindle poles before progressing into anaphase. However, erroneous, non-bioriented attachment states are common and cellular pathways exist to both detect and correct such attachments during cell division. The process by which improper kinetochore-microtubule interactions are destabilized is referred to as error correction. To study error correction in living cells, incorrect attachments are purposely generated via chemical inhibition of kinesin-5 motor, which leads to monopolar spindle assembly, and the transition from mal-orientation to biorientation is observed following drug washout. The large number of chromosomes in many model tissue culture cell types poses a challenge in observing individual error correction events. Drosophila S2 cells are better subjects for such studies as they possess as few as 4 pairs of chromosomes. However, small molecule kinesin-5 inhibitors are ineffective against Drosophila kinesin-5 (Klp61F). Here we describe how to build a Drosophila cell line that effectively replaces Klp61F with human kinesin-5, which renders the cells sensitive to pharmacological inhibition of the motor and suitable for use in the cell-based error correction assay.
Hücre bölünmesi sırasında genomun Eşit ayrımı çoğaltılmış DNA ve iğ mikrotübüller arasında doğru etkileşimi gerektirir. Mikrotübüller fiziksel kinetokor oluşumunu uyarır 1 olarak bilinen sentromer çeviren proteinlerin bir topluluk sayesinde kromozomlar ile etkileşim. Kromozomların doğru dağıtım kardeş kinetokorlar burada her kardeş zıt kutuplarda iğ kaynaklanan mikrotübül ile ilişkili, iki-yönlenmeli gerektirir. Kinetochore mikrotübül (kt-MT) iki-yönde yönlendirilmiş konformasyonunda olmayan ekler hızlı ve verimli hata düzeltme olarak bilinen bir süreç içinde iki yönde yönlendirilmesi kurmak için fırsat sunmak amacıyla istikrarsızlaştırdı edilir. Daha önce, memeli hücrelerinde kurulmuş bir hata düzeltme deney 5 (kinesin-5) Eg5 karşı döner küçük molekül inhibitörleri kullanılarak tek kutuplu iğ monte gerektirir. Ilaç tedavisi hatalı syntelic ekleri çok sayıda üretir both kardeş kinetokorlar aynı iğ kutbuna bağlayın. Uygulanacak ilacın daha sonraki yıkama hata düzeltme işleminin olarak gösterebilir. Hata düzeltme tahlil hatalı kt-MT ekleri düzelterek aday proteinlerin katkısını incelemek için küçük molekül inhibitörleri veya knockdowns varlığında yapılabilir.
Canlı hücreler hata düzeltme görselleştirmek için yeteneği daha bu karmaşık süreçte yer alan moleküler mekanizmayı anlamak için güçlü bir araçtır. Ancak, çoğu hücre hatlarında bulunan kromozomların çok sayıda bireysel kt-MT ekleri gözlemleyerek bir sorun teşkil etmektedir. Onlar kadar az 4 olarak kromozom 6, fakat küçük molekül inhibitörleri içerdiğinden Drosophila S2 hücrelerinin hata düzeltme deneyi uygulamak için ideal olacaktır S-tritil-L-sistein (STLC) halinde kinesin 5 ve 7-9 monastrol Drosophila hücrelerinde mili grubunu ya da kinesin-5 motor fonksiyonu etkilemez. Bu nedenle, cinslerted kinesin-5 inhibitörlerine duyarlıdır bir uyarılabilir promoterin altında insan kinesin-5 eksprese eden bir Drosophila S2 hücre çizgisi. Bu protokol, endojen Drosophila kinesin-5 homologunda, Klp61F demonte ve hücre tabanlı hata düzeltme deneyde bu hücre hattını kullanmayı açıklamaktadır.
Hata düzeltme görselleştirme bu önemli ve kompleks hücresel süreçte yer alan adımları incelemek için değerli bir tekniktir. Bunu yapmak için, hatalı ek parça döner inhibitörleri kullanılarak oluşturulur ve hata düzeltme ilacın yıkanması sırasında gözlenir. Bu deney, ilk olarak, memeli doku kültürü hücreleri 5 kullanılarak geliştirilmiştir. Ancak birçok model, memeli hücre tiplerinde kinetokorlar çok sayıda varlığı, bireysel hata düzeltme olayları gözlemleyerek bir sorun teşkil etmektedir. Drosophila S2 hücrelerinin hata düzeltme gözlemlemek için onlara daha fazla tercih hücre hattı yapım kinetokorlar olarak az 4 olarak çift sahiptirler. Bununla birlikte, önemli bir dezavantajı, birçok inhibitörleri, Drosophila S2 hücrelerinde etkili olmasıdır. Bu nedenle, insan kinesin-5 eksprese eden bir insanlaştırılmış Drosophila S2 hücre çizgisi oluşturma yeteneği hata düzeltme incelemek için değerli bir araç sağlar.
Drosophila S2 hücreleri olabilir, ancak, birhata düzeltme incelemek için daha iyi hücre hattı, hücre hattını elde etmek ve gerekli genleri aşağı vurma katılan çok sayıda adım bu tekniğin bazı zorluklar yaratıyor. Örneğin, transfeksiyon verimi oldukça düşük olabilir. Hücrelerin% 20'den az Eg5-mCherry ifade ediyorsanız seçim süreci uzun sürer olarak, transfeksiyon tekrarlanmalıdır. Ayrıca, her iki floresan proteinleri eksprese eden hücrelerin yüzdesi zamanla azalabilir. Bu, sırasıyla, Eg5-mCherry eksprese eden hücreler ve GFP-α-tubulin seçilmesi için Blastisidin S HCI ve Higromisin B varlığında hücrelerin bölünmesi ile aşılabilir. Bu Drosophila S2 hücrelerinin birçok insan proteinleri ve ortologlara sahip olduğunu not etmek de önemlidir; bu nedenle, endojen proteinler için demonte koşulları optimize etmek için kritiktir. Optimal demonte koşulları dsRNA'nın miktarı ve tedavinin uzunluğu değişebilir. Ortaya çıkışı ve hızla iyileşme dikkate alındığında CRISPR-Cas9 TECHNOLOGI15-17 es, insan Eg5 yerini Klp61F geni ile bir Drosophila hücre hattı nesil transfeksiyonu ve demonte yaklaşımın sınırlamaları aşmak olacağını güçlü bir alternatif sunuyor. Çalışmalarımız gerekli reaktifler halen geliştirilmekte olan Drosophila S2 hücrelerinde bunu her ne kadar sinek-insana gen değişimi bu durumda geçerli bir seçenek olması gerektiğini göstermektedir.
Bu prosedür, Eg5 ile sınırlı değildir, ancak ilgi duyulan diğer proteinlerin fonksiyonu çalışma uygulanabilir. Daha önce Drosophila S2 hücrelerinde etkisiz olduğu kurulmuştur inhibitörleri kullanıyorsanız, bu protokol dışı hedef etkileri hakkında endişeler olmadan canlı hücrelerde inhibitörlerinin direkt etkisini araştırmak için modifiye edilebilir. Bu protokol kullanılarak üretilen hücre çizgisi, aynı zamanda, yüksek verimli tarama kullanılabilecek hata düzeltme katılan proteinleri hedef potansiyel ilaçlar tespit etmek analiz eder.
The authors have nothing to disclose.
Biz kinesin-5 yapının hediye için Patricia Wadsworth teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, Charles H. Hood Vakfı, ınc TJM ve Araştırma Bursu sayılı TJM için Dimes Vakfı Mart ayından itibaren 5 FY13-205 yanı sıra desteğiyle bir NIH hibe (5 R01 GM107026) tarafından desteklenmiştir Boston, MA. TJM için
Effectine Transfection Reagent | Qiagen | 301425 | |
Klp61F cDNA | Drosophila Genomic Resource Center | 13690 | Gene Name LD15641 |
Schneider’s Media | Invitrogen | 21720-024 | |
Fetal Bovine Serum, certified | Invitrogen | 10082-147 | Heat Inactivated, US origin |
Copper (II) Sulfate (CuSO4) | Sigma | C8027-500G | 500mM stock |
S-trityl-l-cysteine | Sigma | 164739-5G | 1mM stock in DMSO |
Blasticidin HCl | Invitrogen | R21001 | 5mg/ml stock in 1x PBS |
Hygromycin B | Invitrogen | 10687010 | |
T7 Large scale RNA Production System | Promega | P1320 | The approximate dsRNA concentration from each reaction is about 5-15µg/µl |
Klp61F RNAi F primer | Invitrogen | TAATACGACTCACTATAGGGTA-TTTGCGCATTATTTTAAAA | |
Klp61F RNAi R primer | Invitrogen | TAATACGACTCACTATAGGGAT-ATTGATCAATTGAAAC | |
PCR clean-up kit | Mo Bio Laboratories, Inc | 1250 | |
Concanavalin A | Sigma | C5275 | 0.5mg/ml solution made by dissolving in 1xPBS. |
Boiled Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch Labs | 017-000-121 | 5% stock solution in 1X PHEM buffer, bring solution up to boil. Stored in 4°C. |
Mounting Media | 20mM Tris pH 8.0, 0.5% N-propyl gallate, 90% Glycerol. Stored in 4°C | ||
1x BRB-80 | 80 mM PIPES pH 6.9; 1 mM EGTA; 1 mM MgCl2 | ||
White Light Source | Lumencor Inc | ||
ET EGFP Filter Cube | Chroma | 49002 | |
DSRed Filter Cube | Chroma | 49005 | |
anti-NDC80 antibody | Custom made by the Maresca Lab | ||
DM1α (anti-α-tubulin) | Sigma | T6199 | |
anti-CID antibody | AbCam | ab10887 |