This protocol describes how to generate a Drosophila S2 cell line that is sensitive to small molecule inhibitors of kinesin-5. The use of these cells in a cell-based error correction assay is also outlined.
Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper distribution of the genetic material requires that sister kinetochores on every chromosome become bioriented by attaching to microtubules from opposite spindle poles before progressing into anaphase. However, erroneous, non-bioriented attachment states are common and cellular pathways exist to both detect and correct such attachments during cell division. The process by which improper kinetochore-microtubule interactions are destabilized is referred to as error correction. To study error correction in living cells, incorrect attachments are purposely generated via chemical inhibition of kinesin-5 motor, which leads to monopolar spindle assembly, and the transition from mal-orientation to biorientation is observed following drug washout. The large number of chromosomes in many model tissue culture cell types poses a challenge in observing individual error correction events. Drosophila S2 cells are better subjects for such studies as they possess as few as 4 pairs of chromosomes. However, small molecule kinesin-5 inhibitors are ineffective against Drosophila kinesin-5 (Klp61F). Here we describe how to build a Drosophila cell line that effectively replaces Klp61F with human kinesin-5, which renders the cells sensitive to pharmacological inhibition of the motor and suitable for use in the cell-based error correction assay.
الفصل المتساوي للجينوم خلال انقسام الخلايا يتطلب التفاعل الصحيح بين الحمض النووي والمغزل الأنابيب الدقيقة منسوخة. الأنابيب الدقيقة التفاعل بأنفسهم مع الكروموسومات من خلال مجموعة متكاملة من البروتينات التي تجمع في القسيم المعروفة باسم الحيز الحركي 1. التوزيع الصحيح للكروموزومات يتطلب أن kinetochores الشقيقة وbioriented، التي يرتبط كل أخت مع الأنابيب الدقيقة النابعة من أقطاب المغزل المعاكس. الحيز الحركي أنيبيب (MT كيلوطن) المرفقات التي ليست في التشكل bioriented يتم بسرعة وكفاءة زعزعة استقرار لإتاحة الفرصة لإقامة biorientation في عملية تعرف باسم تصحيح الخطأ. مقايسة تصحيح الخطأ الذي أنشئ في السابق خلايا الثدييات 5 يتطلب تجميع مغزل أحادي باستخدام مثبطات جزيء صغير عكسها ضد Eg5 (كينيسين-5). العلاج من تعاطي المخدرات يولد العديد من المرفقات syntelic الخاطئة التي بوتkinetochores ح شقيقة نعلق على نفس القطب المغزل. وفشل لاحق من هذا الدواء يسمح لرؤية عملية تصحيح الخطأ. ويمكن أن يتم فحص تصحيح الخطأ في وجود مثبطات جزيء صغير أو knockdowns لدراسة مساهمة البروتينات مرشح لتصحيح الخاطئة إرفاق ملفات KT-MT.
القدرة على تصور تصحيح الخطأ في الخلايا الحية هي أداة قوية لمزيد من فهم الآلية الجزيئية تشارك في هذه العملية المعقدة. ومع ذلك، فإن عددا كبيرا من الكروموسومات الموجودة في معظم خطوط الخلايا يشكل تحديا في مراقبة الفردية إرفاق ملفات KT-MT. فإن خلايا ذبابة الفاكهة S2 يكون مثاليا لتطبيق فحص تصحيح الخطأ لأنها تحتوي على عدد قليل من 4 الكروموزومات 6، ولكن مثبطات جزيء صغير من كينيسين 5 مثل S-trityl-L-السيستين (STLC) وmonastrol 7-9 لا تؤثر التجمع المغزل أو كينيسين-5 وظيفة الحركة في خلايا ذبابة الفاكهة. وبالتالي فإننا أجناستيد خط خلية ذبابة الفاكهة S2 معربا عن كينيسين-5 البشري تحت المروج محرض التي تعتبر حساسة لكينيسين-5 مثبطات. يصف هذا البروتوكول كيفية ضربة قاضية للالذاتية ذبابة الفاكهة كينيسين-5 نديد، Klp61F، واستخدام هذا الخط خلية في خلية القاعدة تصحيح الخطأ الفحص.
تصور تصحيح الخطأ هو أسلوب قيمة لدراسة الخطوات المتبعة في هذه العملية الخلوية الهامة والمعقدة. للقيام بذلك، يتم إنشاء المرفقات الخاطئة باستخدام مثبطات عكسها، ورصدت تصحيح الخطأ على فشل الدواء. وقد تم تطوير هذا الفحص أصلا باستخدام خلايا الثقافة أنسجة الثدييات 5. ومع وجود عدد كبير من kinetochores في العديد من نموذج أنواع خلايا الثدييات يشكل تحديا في مراقبة الأحداث الفردية تصحيح الخطأ. خلايا ذبابة الفاكهة S2 تمتلك عدد قليل من 4 أزواج من kinetochores، مما يجعلها خط الخلية أكثر الأفضل لمراقبة تصحيح الخطأ. ومع ذلك، فإن العيب الرئيسي هو أن العديد من مثبطات غير فعالة في خلايا ذبابة الفاكهة S2. وهكذا، والقدرة على توليد خط خلية ذبابة الفاكهة S2 أنسنة الإنسان معربا عن كينيسين-5 يوفر أداة قيمة لدراسة تصحيح الخطأ.
على الرغم من أن خلايا ذبابة الفاكهة S2 يمكن أن يكونخط الخلية أفضل لدراسة تصحيح الخطأ، والخطوات المتعددة التي ينطوي عليها الحصول على خط الخلية وهدمت الجينات الأساسية تطرح بعض التحديات التي تواجه هذه التقنية. على سبيل المثال، يمكن أن يكون كفاءة ترنسفكأيشن منخفضة جدا. إذا كانت أقل من 20٪ من الخلايا تعبر عن Eg5-mCherry، وينبغي تكرار ترنسفكأيشن كما عملية الاختيار سوف يستغرق وقتا أطول. أيضا، فإن النسبة المئوية للخلايا التعبير عن كل البروتينات الفلورية قد ينخفض مع مرور الوقت. يمكن التغلب على ذلك عن طريق تقسيم الخلايا في وجود Blasticidin S حمض الهيدروكلوريك وهيغروميسين B لتحديد الخلايا معربا عن Eg5-mCherry وGFP-α تويولين، على التوالي. ومن المهم أيضا أن نلاحظ أن الخلايا ذبابة الفاكهة S2 لها orthologues إلى العديد من البروتينات البشرية و. لذا، فمن الأهمية بمكان لتحسين ظروف ضربة قاضية للبروتينات الذاتية. قد تختلف الظروف المثلى ضربة قاضية في كمية الرنا المزدوج الجديلة وطول فترة العلاج. وبالنظر إلى ظهور والتحسن السريع للكريسبر-Cas9 تكنولوجىوفاق 15-17، وتوليد خط خلية ذبابة الفاكهة مع الجين Klp61F استبداله Eg5 البشري يقدم بديلا قويا من شأنه التغلب على القيود المفروضة على ترنسفكأيشن ونهج ضربة قاضية. يوضح عملنا أن ذبابة لالبشري استبدال الجينات يجب أن يكون خيارا قابلا للتطبيق في هذه الحالة على الرغم من الكواشف اللازمة للقيام بذلك في خلايا ذبابة الفاكهة S2 يجري حاليا تطويرها.
ولا يقتصر هذا الإجراء لEg5، ولكن يمكن تطبيقها على دراسة وظيفة البروتينات الأخرى ذات الاهتمام. في حالة استخدام مثبطات التي سبق لها أن أنشئت لتكون فعالة في خلايا ذبابة الفاكهة S2، هذا البروتوكول يمكن تعديلها لدراسة التأثير المباشر لمثبطات في الخلايا الحية دون القلق بشأن آثار الهدف خارج. ويمكن أيضا أن خط الخلية المنتجة باستخدام هذا البروتوكول أن تستخدم في فحص عالية الإنتاجية تحليل لتحديد الأدوية التي تستهدف البروتينات المحتملة التي ينطوي عليها تصحيح الخطأ.
The authors have nothing to disclose.
ونود أن نشكر باتريشيا ادز ورث عن هدية من كينيسين-5 بناء. وأيد هذا العمل من منحة المعاهد الوطنية للصحة (5 R01 GM107026) لTJM والبحوث منحة رقم 5 FY13-205 من مارس من مؤسسة مليم لTJM، وكذلك بدعم من مؤسسة تشارلز H. هود، وشركة، بوسطن، MA. لTJM
Effectine Transfection Reagent | Qiagen | 301425 | |
Klp61F cDNA | Drosophila Genomic Resource Center | 13690 | Gene Name LD15641 |
Schneider’s Media | Invitrogen | 21720-024 | |
Fetal Bovine Serum, certified | Invitrogen | 10082-147 | Heat Inactivated, US origin |
Copper (II) Sulfate (CuSO4) | Sigma | C8027-500G | 500mM stock |
S-trityl-l-cysteine | Sigma | 164739-5G | 1mM stock in DMSO |
Blasticidin HCl | Invitrogen | R21001 | 5mg/ml stock in 1x PBS |
Hygromycin B | Invitrogen | 10687010 | |
T7 Large scale RNA Production System | Promega | P1320 | The approximate dsRNA concentration from each reaction is about 5-15µg/µl |
Klp61F RNAi F primer | Invitrogen | TAATACGACTCACTATAGGGTA-TTTGCGCATTATTTTAAAA | |
Klp61F RNAi R primer | Invitrogen | TAATACGACTCACTATAGGGAT-ATTGATCAATTGAAAC | |
PCR clean-up kit | Mo Bio Laboratories, Inc | 1250 | |
Concanavalin A | Sigma | C5275 | 0.5mg/ml solution made by dissolving in 1xPBS. |
Boiled Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch Labs | 017-000-121 | 5% stock solution in 1X PHEM buffer, bring solution up to boil. Stored in 4°C. |
Mounting Media | 20mM Tris pH 8.0, 0.5% N-propyl gallate, 90% Glycerol. Stored in 4°C | ||
1x BRB-80 | 80 mM PIPES pH 6.9; 1 mM EGTA; 1 mM MgCl2 | ||
White Light Source | Lumencor Inc | ||
ET EGFP Filter Cube | Chroma | 49002 | |
DSRed Filter Cube | Chroma | 49005 | |
anti-NDC80 antibody | Custom made by the Maresca Lab | ||
DM1α (anti-α-tubulin) | Sigma | T6199 | |
anti-CID antibody | AbCam | ab10887 |