This protocol describes how to generate a Drosophila S2 cell line that is sensitive to small molecule inhibitors of kinesin-5. The use of these cells in a cell-based error correction assay is also outlined.
Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper distribution of the genetic material requires that sister kinetochores on every chromosome become bioriented by attaching to microtubules from opposite spindle poles before progressing into anaphase. However, erroneous, non-bioriented attachment states are common and cellular pathways exist to both detect and correct such attachments during cell division. The process by which improper kinetochore-microtubule interactions are destabilized is referred to as error correction. To study error correction in living cells, incorrect attachments are purposely generated via chemical inhibition of kinesin-5 motor, which leads to monopolar spindle assembly, and the transition from mal-orientation to biorientation is observed following drug washout. The large number of chromosomes in many model tissue culture cell types poses a challenge in observing individual error correction events. Drosophila S2 cells are better subjects for such studies as they possess as few as 4 pairs of chromosomes. However, small molecule kinesin-5 inhibitors are ineffective against Drosophila kinesin-5 (Klp61F). Here we describe how to build a Drosophila cell line that effectively replaces Klp61F with human kinesin-5, which renders the cells sensitive to pharmacological inhibition of the motor and suitable for use in the cell-based error correction assay.
Gelijke scheiding van het genoom tijdens celdeling vereist juiste interacties tussen de gerepliceerde DNA en spindle microtubules. Microtubules fysisch interageren met chromosomen door een ensemble van eiwitten die assembleert op centromeren zogenaamde kinetochoor 1. Juiste verdeling van de chromosomen vereist dat zuster kinetochoren worden gebioriënteerde, waarbij iedere zuster wordt geassocieerd met microtubules afkomstig vanuit tegengestelde spoel polen. Kinetochoor microtubule (kt-MT) bijlagen die niet in de Bioriented conformatie worden snel en efficiënt gedestabiliseerd de gelegenheid om biorientation vestigen in een proces dat bekend staat als foutcorrectie bieden. Een foutcorrectie test die eerder in zoogdiercellen werd opgericht 5 vereist het assembleren monopolar spindels met omkeerbare klein molecuul remmers tegen Eg5 (kinesine-5). De behandeling met geneesmiddelen genereert een veelheid van foutieve syntelic bijlagen waarin both zuster kinetochoren hechten aan dezelfde spil paal. Een volgende uitwassen van het geneesmiddel maakt visualisatie van het foutcorrectieproces. De foutcorrectie test kan worden uitgevoerd in aanwezigheid van kleine molecule inhibitoren of knockdowns de bijdrage van kandidaat eiwitten te bestuderen corrigeren van foutieve kt-MT attachments.
De mogelijkheid om foutcorrectie te visualiseren in levende cellen is een krachtig instrument om inzicht in de moleculaire mechanismen betrokken bij dit complex proces. Echter, het grote aantal chromosomen in de meeste cellijnen vormt een uitdaging waarnemen individuele kt-MT attachments. Drosophila S2-cellen zou ideaal zijn voor toepassing van foutcorrectie assay als ze zo weinig als 4 chromosomen 6, maar kleine molecule inhibitoren bevatten kinesine 5 zoals S-trityl-L-cysteïne (STLC) en monastrol 7-9 hebben geen invloed spileenheid of kinesine-5 motorfunctie di Drosophila-cellen. Daarom generated een Drosophila S2-cellijn die humane kinesine-5 onder een induceerbare promoter die gevoelig is voor kinesine-5 remmers. Dit protocol beschrijft hoe de endogene Drosophila kinesine-5 homoloog, Klp61F knockdown, en het gebruik van deze cellijn in de cel-gebaseerde foutcorrectie test.
Visualiseren foutcorrectie is een waardevolle techniek om de stappen betrokken bij dit belangrijke en complexe cellen te bestuderen. Hiertoe worden foutieve bijlagen gegenereerd met omkeerbare remmers en foutcorrectie wordt waargenomen na uitwassen van het geneesmiddel. Deze test werd oorspronkelijk ontwikkeld met behulp van zoogdieren weefselkweek cellen 5. Maar de aanwezigheid van talrijke kinetochoren vele model zoogdierceltypen een uitdaging in het observeren afzonderlijke foutencorrectie gebeurtenissen. Drosophila S2-cellen bezitten weinig als 4 paren van kinetochoren, waardoor ze een grotere voorkeur cellijn voor het observeren foutcorrectie. Echter, een belangrijk nadeel is dat veel remmers effectief di Drosophila S2-cellen. Dus de mogelijkheid om een gehumaniseerd Drosophila S2-cellijn die humaan kinesine-5 een waardevol hulpmiddel voor foutcorrectie bestuderen.
Hoewel Drosophila S2 cellen kan eenbeter cellijn om foutcorrectie te bestuderen, de verschillende stappen die betrokken zijn bij het verkrijgen van de cellijn en neerhalen essentiële genen stelt een aantal uitdagingen om deze techniek. Zo kan transfectie-efficiëntie behoorlijk laag. Indien minder dan 20% van de cellen tot expressie de Eg5-mCherry, dient de transfectie worden herhaald als het selectieproces langer duren. Ook kan het percentage cellen die zowel fluorescerende eiwitten tijd afnemen. Dit kan worden ondervangen door het splitsen van cellen in aanwezigheid van Blasticidine S HCl en hygromycine B om te selecteren op cellen die Eg5-mCherry en GFP-α-tubuline, respectievelijk. Het is ook belangrijk op te merken dat Drosophila S2 cellen orthologen te veel menselijke eiwitten en; Daarom is het essentieel om de knockdown voorwaarden voor endogene eiwitten te optimaliseren. Optimale knockdown kunnen variëren in de hoeveelheid van dsRNA en de duur van de behandeling. Gezien de opkomst en snelle verbetering van CRISPR-Cas9 Technologies 15-17, genereren van een Drosophila-cellijn met Klp61F gen vervangen door menselijke Eg5 presenteert een krachtig alternatief dat de beperkingen van de transfectie en knock-down benadering zou overwinnen. Ons werk toont die vliegen op mens genvervanging een haalbare optie in dit geval zijn, hoewel de benodigde reagentia daartoe in Drosophila S2-cellen worden momenteel ontwikkeld.
Deze procedure is niet beperkt tot Eg5, maar kunnen worden toegepast om de functie van andere eiwitten van belang te bestuderen. Bij gebruik van remmers die eerder zijn vastgesteld ineffectief di Drosophila S2 cellen te zijn, kan dit protocol worden aangepast om de rechtstreekse werking van remmers in levende cellen zonder zorgen over palen effecten te bestuderen. De cellijn verkregen met dit protocol kan ook worden gebruikt in high-throughput screening analyses potentiële medicijnen die eiwitten betrokken bij het foutcorrectie identificeren.
The authors have nothing to disclose.
We willen graag Patricia Wadsworth bedanken voor de gave van de kinesine-5 construct. Dit werk werd ondersteund door een NIH-subsidie (5 R01 GM107026) naar TJM en door Research Grant No. 5-FY13-205 van de in maart van Dimes Stichting TJM, alsmede steun van de Charles H. Hood Foundation, Inc., Boston, MA. naar TJM
Effectine Transfection Reagent | Qiagen | 301425 | |
Klp61F cDNA | Drosophila Genomic Resource Center | 13690 | Gene Name LD15641 |
Schneider’s Media | Invitrogen | 21720-024 | |
Fetal Bovine Serum, certified | Invitrogen | 10082-147 | Heat Inactivated, US origin |
Copper (II) Sulfate (CuSO4) | Sigma | C8027-500G | 500mM stock |
S-trityl-l-cysteine | Sigma | 164739-5G | 1mM stock in DMSO |
Blasticidin HCl | Invitrogen | R21001 | 5mg/ml stock in 1x PBS |
Hygromycin B | Invitrogen | 10687010 | |
T7 Large scale RNA Production System | Promega | P1320 | The approximate dsRNA concentration from each reaction is about 5-15µg/µl |
Klp61F RNAi F primer | Invitrogen | TAATACGACTCACTATAGGGTA-TTTGCGCATTATTTTAAAA | |
Klp61F RNAi R primer | Invitrogen | TAATACGACTCACTATAGGGAT-ATTGATCAATTGAAAC | |
PCR clean-up kit | Mo Bio Laboratories, Inc | 1250 | |
Concanavalin A | Sigma | C5275 | 0.5mg/ml solution made by dissolving in 1xPBS. |
Boiled Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch Labs | 017-000-121 | 5% stock solution in 1X PHEM buffer, bring solution up to boil. Stored in 4°C. |
Mounting Media | 20mM Tris pH 8.0, 0.5% N-propyl gallate, 90% Glycerol. Stored in 4°C | ||
1x BRB-80 | 80 mM PIPES pH 6.9; 1 mM EGTA; 1 mM MgCl2 | ||
White Light Source | Lumencor Inc | ||
ET EGFP Filter Cube | Chroma | 49002 | |
DSRed Filter Cube | Chroma | 49005 | |
anti-NDC80 antibody | Custom made by the Maresca Lab | ||
DM1α (anti-α-tubulin) | Sigma | T6199 | |
anti-CID antibody | AbCam | ab10887 |