This protocol describes how to generate a Drosophila S2 cell line that is sensitive to small molecule inhibitors of kinesin-5. The use of these cells in a cell-based error correction assay is also outlined.
Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper distribution of the genetic material requires that sister kinetochores on every chromosome become bioriented by attaching to microtubules from opposite spindle poles before progressing into anaphase. However, erroneous, non-bioriented attachment states are common and cellular pathways exist to both detect and correct such attachments during cell division. The process by which improper kinetochore-microtubule interactions are destabilized is referred to as error correction. To study error correction in living cells, incorrect attachments are purposely generated via chemical inhibition of kinesin-5 motor, which leads to monopolar spindle assembly, and the transition from mal-orientation to biorientation is observed following drug washout. The large number of chromosomes in many model tissue culture cell types poses a challenge in observing individual error correction events. Drosophila S2 cells are better subjects for such studies as they possess as few as 4 pairs of chromosomes. However, small molecule kinesin-5 inhibitors are ineffective against Drosophila kinesin-5 (Klp61F). Here we describe how to build a Drosophila cell line that effectively replaces Klp61F with human kinesin-5, which renders the cells sensitive to pharmacological inhibition of the motor and suitable for use in the cell-based error correction assay.
Igual a segregação do genoma durante a divisão celular requer interacções entre as correctas microtúbulos fusiformes ADN e replicados. Os microtúbulos interagir fisicamente com os cromossomas por meio de um conjunto de proteínas que se monta em centrómeros conhecidos como o cinetocoro 1. Distribuição correta dos cromossomos exige que cinetócoros irmãos são biorientado, em que cada irmã está associada a microtúbulos provenientes de pólos opostos do fuso. Kinetochore microtúbulos (KT-MT) anexos que não estão na conformação biorientado são rápida e eficientemente desestabilizada para proporcionar a oportunidade para estabelecer biorientation num processo conhecido como correcção de erros. Um ensaio de correcção de erros que foi previamente estabelecida em células de mamíferos requer montagem 5 fusos monopolares utilizando inibidores de moléculas pequenas reversíveis contra Eg5 (cinesina-5). O tratamento da droga gera uma infinidade de acessórios syntelic errôneas em que botcinetócoros h irmãos anexar ao mesmo pólo do fuso. Uma lavagem subsequente do fármaco, permite a visualização do processo de correcção de erro. O ensaio de correcção de erros pode ser realizada na presença de inibidores de moléculas pequenas ou knockdowns para estudar a contribuição de proteínas candidatas para corrigir erróneos anexos KT-MT.
A habilidade de visualizar a correcção de erros em células vivas é uma ferramenta poderosa para melhor compreender o mecanismo molecular envolvido neste processo complexo. No entanto, o grande número de cromossomas presentes na maioria das linhas celulares coloca um desafio na observação anexos KT-MT individuais. As células S2 de Drosophila seria ideal para a aplicação do ensaio de correcção de erro à medida que conter tão poucos como 4 cromossomas 6, mas os inibidores de moléculas pequenas de cinesina 5 tal como S-tritil-L-cisteína (STLC) e monastrol 7-9 não afecta a formação do fuso ou cinesina-5 função motora em células de Drosophila. Nós, portanto, gênerosTed uma linha de células S2 de Drosophila expressando cinesina-5 humana sob um promotor indutível que é sensível aos inibidores da cinesina-5. Este protocolo descreve como o knockdown endógena Drosophila cinesina-5 homólogo, Klp61F, e usar esta linha de células no ensaio de correcção de erros com base em células.
A visualização de correcção de erros é uma técnica valiosa para estudar as etapas envolvidas neste processo celular importante e complexo. Para fazê-lo, os anexos erradas são gerados usando inibidores reversíveis, e correcção de erros é observada mediante lavagem do fármaco. Este ensaio foi inicialmente desenvolvido utilizando células de cultura de tecidos de mamíferos, 5. No entanto, a presença de grande número de cinetocoros em muitos tipos de células de mamíferos modelo coloca um desafio na observação de eventos individuais de correcção de erros. As células S2 de Drosophila possuem tão poucos como 4 pares de cinetocoros, tornando-as numa linha celular mais preferível para a observação de correcção de erros. No entanto, uma grande desvantagem é que muitos inibidores são ineficazes em células S2 de Drosophila. Assim, a capacidade de gerar uma linha de células S2 de Drosophila expressando humana humanizado cinesina-5 fornece uma ferramenta valiosa para estudar a correcção de erros.
Embora as células S2 de Drosophila pode ser ummelhor linha celular para estudar a correção de erros, as várias etapas envolvidas na obtenção da linha celular e derrubando genes essenciais coloca alguns desafios para esta técnica. Por exemplo, a eficiência da transfecção pode ser muito baixo. Se menos de 20% das células expressam o Eg5-mCherry, a transfecção deve ser repetido o processo de selecção como irá demorar mais tempo. Além disso, a percentagem de células que expressam ambas as proteínas fluorescentes pode diminuir ao longo do tempo. Isto pode ser superado através da divisão de células na presença de Blasticidina S HCl e higromicina B para seleccionar as células que expressam Eg5-mCherry e GFP-α-tubulina, respectivamente. É também importante notar que as células S2 de Drosophila têm ortólogos para muitas proteínas e humanos; Portanto, é essencial para optimizar as condições de knockdown para as proteínas endógenas. Condições óptimas de knockdown pode variar na quantidade de ARNdc e a duração do tratamento. Considerando-se o surgimento e rápida melhoria das CRISPR-Cas9 Technologies 15-17, a geração de uma linha de células de Drosophila com o gene Klp61F substituído por Eg5 humano apresenta uma alternativa poderosa capaz de superar as limitações da transfecção e abordagem knockdown. Nosso trabalho demonstra que a mosca-a-homem substituição gene deve ser uma opção viável neste caso, embora os reagentes necessários para fazê-lo em células de Drosophila S2 estão sendo desenvolvidos atualmente.
Este processo não está limitado a Eg5, mas pode ser aplicado para estudar a função de outras proteínas de interesse. Se o uso de inibidores que tenham sido previamente estabelecidos para ser ineficaz em células de Drosophila S2, este protocolo pode ser modificado para se estudar o efeito direto de inibidores em células vivas, sem preocupações sobre os efeitos alvo fora. A linha celular produzida usando este protocolo pode também ser utilizada no rastreio de alto rendimento para identificar as análises potenciais drogas que visam proteínas envolvidas na correcção de erro.
The authors have nothing to disclose.
Gostaríamos de agradecer a Patricia Wadsworth para o dom do kinesin-5 construção. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa NIH (5 R01 GM107026) para TJM e pela Research Grant No. 5-FY13-205 da March of Dimes Foundation para TJM, bem como o apoio da Charles H. capa Foundation, Inc., Boston, MA. para TJM
Effectine Transfection Reagent | Qiagen | 301425 | |
Klp61F cDNA | Drosophila Genomic Resource Center | 13690 | Gene Name LD15641 |
Schneider’s Media | Invitrogen | 21720-024 | |
Fetal Bovine Serum, certified | Invitrogen | 10082-147 | Heat Inactivated, US origin |
Copper (II) Sulfate (CuSO4) | Sigma | C8027-500G | 500mM stock |
S-trityl-l-cysteine | Sigma | 164739-5G | 1mM stock in DMSO |
Blasticidin HCl | Invitrogen | R21001 | 5mg/ml stock in 1x PBS |
Hygromycin B | Invitrogen | 10687010 | |
T7 Large scale RNA Production System | Promega | P1320 | The approximate dsRNA concentration from each reaction is about 5-15µg/µl |
Klp61F RNAi F primer | Invitrogen | TAATACGACTCACTATAGGGTA-TTTGCGCATTATTTTAAAA | |
Klp61F RNAi R primer | Invitrogen | TAATACGACTCACTATAGGGAT-ATTGATCAATTGAAAC | |
PCR clean-up kit | Mo Bio Laboratories, Inc | 1250 | |
Concanavalin A | Sigma | C5275 | 0.5mg/ml solution made by dissolving in 1xPBS. |
Boiled Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch Labs | 017-000-121 | 5% stock solution in 1X PHEM buffer, bring solution up to boil. Stored in 4°C. |
Mounting Media | 20mM Tris pH 8.0, 0.5% N-propyl gallate, 90% Glycerol. Stored in 4°C | ||
1x BRB-80 | 80 mM PIPES pH 6.9; 1 mM EGTA; 1 mM MgCl2 | ||
White Light Source | Lumencor Inc | ||
ET EGFP Filter Cube | Chroma | 49002 | |
DSRed Filter Cube | Chroma | 49005 | |
anti-NDC80 antibody | Custom made by the Maresca Lab | ||
DM1α (anti-α-tubulin) | Sigma | T6199 | |
anti-CID antibody | AbCam | ab10887 |