This protocol describes how to generate a Drosophila S2 cell line that is sensitive to small molecule inhibitors of kinesin-5. The use of these cells in a cell-based error correction assay is also outlined.
Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper distribution of the genetic material requires that sister kinetochores on every chromosome become bioriented by attaching to microtubules from opposite spindle poles before progressing into anaphase. However, erroneous, non-bioriented attachment states are common and cellular pathways exist to both detect and correct such attachments during cell division. The process by which improper kinetochore-microtubule interactions are destabilized is referred to as error correction. To study error correction in living cells, incorrect attachments are purposely generated via chemical inhibition of kinesin-5 motor, which leads to monopolar spindle assembly, and the transition from mal-orientation to biorientation is observed following drug washout. The large number of chromosomes in many model tissue culture cell types poses a challenge in observing individual error correction events. Drosophila S2 cells are better subjects for such studies as they possess as few as 4 pairs of chromosomes. However, small molecule kinesin-5 inhibitors are ineffective against Drosophila kinesin-5 (Klp61F). Here we describe how to build a Drosophila cell line that effectively replaces Klp61F with human kinesin-5, which renders the cells sensitive to pharmacological inhibition of the motor and suitable for use in the cell-based error correction assay.
Lika segregering av genomet under celldelningen kräver rätt växelverkan mellan replikerade DNA och spindel mikrotubuli. Mikrotubuli fysiskt interagera med kromosomer genom en ensemble av proteiner som monterar på centromerer kallas kinetochore 1. Korrekt fördelning av kromosomerna kräver att syster kinetokorer är biorienterad, där varje syster är associerad med mikrotubuli som härrör från motsatta spindel poler. Kinetochor mikrotubulus (kt-MT) bilagor som inte finns i biorienterad konforma snabbt och effektivt destabiliseras för att ge möjlighet att etablera biorientation i en process som kallas felkorrigering. Ett felkorrigering analys som tidigare grundades i däggdjursceller 5 kräver montering monopolära spindlar använder reversibla småmolekylinhibitorer mot Eg5 (kinesin-5). Läkemedelsbehandling genererar en mängd felaktiga syntelic bilagor i vilken both syster kinetokorer fäster vid samma spindel stolpe. En efterföljande uttvättning av läkemedlet medger visualisering av felkorrigeringsprocessen. Felkorrigering analysen kan göras i närvaro av små molekylhämmare eller knockdowns att studera bidraget av kandidatproteiner att korrigera felaktiga kt-MT bilagor.
Förmågan att visualisera felkorrigering i levande celler är ett kraftfullt verktyg för att ytterligare förstå den molekylära mekanism som är involverad i denna komplicerade process. Det stora antalet kromosomer närvarande i de flesta cellinjer är en utmaning i att observera individuella kt-MT bilagor. Drosophila S2-celler skulle vara perfekt för applicering av felkorrigering analysen, eftersom de innehåller så få som fyra kromosomer 6, men småmolekylära hämmare av kinesin 5 såsom S-trityl-L-cystein (STLC) och monastrol 7-9 påverkar inte spindelenhet eller kinesin-5 motorisk funktion i Drosophila-celler. Vi har därför släktented en Drosophila S2 cellinje som uttrycker human kinesin-5 under en inducerbar promotor som är känslig för kinesin-5-hämmare. Detta protokoll beskriver hur man VÄLDIGANDE den endogena Drosophila kinesin-5 homolog, Klp61F och använda denna cellinje i cellbaserade felkorrigering analys.
Visualisera felkorrigering är en värdefull teknik för att studera de olika stegen i denna viktiga och komplexa cellulär process. För att göra detta, är felaktiga bilagor genereras med hjälp reversibla inhibitorer, och felkorrigering observeras vid uttvättning av läkemedlet. Denna analys var ursprungligen utvecklats med hjälp av däggdjursvävnadsodlingsceller 5. Emellertid närvaron av stora antal av kinetokorer i många modelldäggdjurscelltyper utgör en utmaning i att observera individuella felkorrigering händelser. Drosophila S2-celler har så få som fyra par av kinetokorer, vilket gör dem en mer föredragen cellinje för att observera felkorrigering. Emellertid är en stor nackdel att många inhibitorer är ineffektiva i Drosophila S2-celler. Således, ger möjlighet att skapa en humaniserad Drosophila S2 cellinje som uttrycker human kinesin-5 ett värdefullt verktyg för att studera felkorrigering.
Även om Drosophila S2-celler kan vara enbättre cellinje för att studera felkorrigering, de många stegen i att erhålla cellinje och knackar ner essentiella gener innebär vissa utmaningar för denna teknik. Till exempel kan transfektionseffektiviteten vara ganska låg. Om mindre än 20% av cellerna uttrycker Eg5-mCherry, bör transfektion upprepas så urvalsprocessen tar längre tid. Dessutom kan den procentuella andelen celler som uttrycker båda fluorescerande proteiner minska med tiden. Detta kan övervinnas genom att dela celler i närvaro av Blasticidin S HCl och hygromycin B för att välja med avseende på celler som uttrycker Eg5-mCherry och GFP-α-tubulin, respektive. Det är också viktigt att notera att Drosophila S2-celler har ortologer till många humana proteiner och; Därför, är det viktigt att optimera de knockdown villkoren för de endogena proteinerna. Optimala knockdown förhållanden kan variera i mängd dsRNA och längden av behandlingen. Med tanke på uppkomsten och snabb förbättring av crispr-Cas9 Technoes 15-17, generering av en Drosophila-cellinje med Klp61F genen ersatts med humant Eg5 presenteras ett kraftfullt alternativ som skulle övervinna begränsningarna hos transfektionen och knockdown tillvägagångssätt. Vårt arbete visar att fly till människa genutbyte ska vara ett hållbart alternativ i det här fallet, även om de nödvändiga reagens för att göra det i Drosophila S2-celler utvecklas för närvarande.
Detta förfarande är inte begränsat till Eg5, utan kan tillämpas för att studera funktionen av andra proteiner av intresse. Om du använder inhibitorer som tidigare har inrättats för att vara ineffektiva i Drosophila S2-celler, kan detta protokoll ändras för att studera den direkta effekten av inhibitorer i levande celler utan oro från målet effekter. Cellinjen produceras med användning av detta protokoll kan också användas i high-throughput screening-analyser för att identifiera potentiella läkemedel riktade proteiner involverade i felkorrigering.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Patricia Wadsworth för gåvan av kinesin-5 konstruktionen. Detta arbete stöddes av en NIH bidrag (5 R01 GM107026) till TJM och av Research Grant nr 5-FY13-205 från March of Dimes Foundation till TJM, samt stöd från Charles H. Hood Foundation, Inc., Boston, MA. till TJM
Effectine Transfection Reagent | Qiagen | 301425 | |
Klp61F cDNA | Drosophila Genomic Resource Center | 13690 | Gene Name LD15641 |
Schneider’s Media | Invitrogen | 21720-024 | |
Fetal Bovine Serum, certified | Invitrogen | 10082-147 | Heat Inactivated, US origin |
Copper (II) Sulfate (CuSO4) | Sigma | C8027-500G | 500mM stock |
S-trityl-l-cysteine | Sigma | 164739-5G | 1mM stock in DMSO |
Blasticidin HCl | Invitrogen | R21001 | 5mg/ml stock in 1x PBS |
Hygromycin B | Invitrogen | 10687010 | |
T7 Large scale RNA Production System | Promega | P1320 | The approximate dsRNA concentration from each reaction is about 5-15µg/µl |
Klp61F RNAi F primer | Invitrogen | TAATACGACTCACTATAGGGTA-TTTGCGCATTATTTTAAAA | |
Klp61F RNAi R primer | Invitrogen | TAATACGACTCACTATAGGGAT-ATTGATCAATTGAAAC | |
PCR clean-up kit | Mo Bio Laboratories, Inc | 1250 | |
Concanavalin A | Sigma | C5275 | 0.5mg/ml solution made by dissolving in 1xPBS. |
Boiled Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch Labs | 017-000-121 | 5% stock solution in 1X PHEM buffer, bring solution up to boil. Stored in 4°C. |
Mounting Media | 20mM Tris pH 8.0, 0.5% N-propyl gallate, 90% Glycerol. Stored in 4°C | ||
1x BRB-80 | 80 mM PIPES pH 6.9; 1 mM EGTA; 1 mM MgCl2 | ||
White Light Source | Lumencor Inc | ||
ET EGFP Filter Cube | Chroma | 49002 | |
DSRed Filter Cube | Chroma | 49005 | |
anti-NDC80 antibody | Custom made by the Maresca Lab | ||
DM1α (anti-α-tubulin) | Sigma | T6199 | |
anti-CID antibody | AbCam | ab10887 |