CN-GELFrEE - Klar Native Gel-elueres væskefraktion Fastklemning Elektroforese
Summary
This protocol describes how to prepare and perform clear native gel-eluted liquid fraction entrapment electrophoresis (CN-GELFrEE), a native separation technique for non-covalent biomolecular assemblies and proteins from heterogeneous samples that is compatible with various downstream protein analysis techniques.
Abstract
Proteinkomplekser udføre en række vigtige cellulære funktioner. Belyse deres ikke-kovalente interaktioner og dynamik er afgørende for at forstå betydningen af komplekser i biologiske systemer. Mens den direkte karakterisering af biomolekylære samlinger er blevet stadig vigtigere i de senere år, native fraktioneringsteknikker der er kompatible med efterfølgende analyse teknikker, herunder massespektrometri, er nødvendige for yderligere at udvide disse undersøgelser. Alligevel feltet mangler en high-throughput, wide-range, high-recovery separation fremgangsmåde til nativt protein samlinger. Her præsenteres klar nativ væskefraktion gel-elueret fastklemning elektroforese (CN-GELFrEE), som er en hidtil ukendt adskillelse modalitet for ikke-kovalente protein-aggregater. CN-GELFrEE adskillelse præstation blev demonstreret ved fraktionering komplekser udvundet af mus hjerte. Fraktioner blev opsamlet over 2 timer og vises adskilte bånd spænder over ~ 30 til 500 kDa. En conkonsistent mønster af stigende molekylvægt båndbredder blev observeret, hver spænder ~ 100 kDa. Endvidere efterfølgende reanalyse af native fraktioner ved SDS-PAGE viste molekylvægt flytter overensstemmelse med denaturering af proteinkomplekser. Derfor blev CN-GELFrEE vist sig at tilbyde evnen til at udføre høj opløsning og høj-recovery native separationer på proteinkomplekser fra et stort molekylvægtsområde, giver fraktioner, der er kompatible med nedstrøms protein analyser.
Introduction
Størstedelen af biologiske processer finder sted i en celle menes at blive udført af protein samlinger snarere end enkelte proteiner 1. For således at belyse den specifikke biologiske rolle af et protein subunit i en celle er det nødvendigt at forstå dens strukturelle interaktioner med andre proteiner eller ligander i komplekser 2. Men studerer proteiner indbygget, at opretholde deres ikke-kovalente interaktioner og aktivitet, er fortsat udfordrende. En af ulemperne ved native proteinstudier er en egnet nativt separationsteknik, der er kompatibel med forskellige downstream protein analyseteknikker. Derfor har de seneste interesse i separationsteknikker stand til at karakterisere ikke-kovalente samlinger af biomolekyler steget kraftigt 3.
Protein separationsteknikker er bydende nødvendigt at biokemi, biofysik og forskellige andre undersøgelser. Aktuelle native separationsteknikker har intrinsic mangler, der reducerer kompatibilitet med efterfølgende analyser, såsom lav opløsning, lille produktion, tab til nedbør, og kravet om store mængder oprindelige stikprøve. Tandem affinitetsoprensning er almindeligt anvendt for protein interaktionsstudier, men det skal udføres separat for hvert protein mål, får det til at være uforenelig med high-throughput analyse 4. Gelpermeationskromatografi 5, selektiv fældning med ion-affinitetskromatografi 5 og densitet-gradient separation 6 alle har givet native separationer, men er i sagens natur lav opløsning teknikker og kræver høje indledende prøvemængde.
Alternativt gel-baserede teknikker, såsom blå Native (BN) og Clear Native (CN) PAGE (enten 1-D eller 2-D), viser høj opløsning separation. Desuden, i modsætning til andre teknikker nævnt, både indfødte SIDE separationer opretholde opløselighed og native konformation af en bred range af makromolekyle arter, herunder hydrofobe proteiner. Denne evne udvider yderligere proteomet dækning nås med disse fremgangsmåder 7,8, og der opnås gennem forskellige kemi mellem CN og BN-PAGE. CN-PAGE almindeligt afhængig blød ladede rengøringsmidler som bærermolekyler, erstatter Coomassie blå farvestof i BN-PAGE. BN-PAGE, selv forbundet med højere opløsning, har forbehold såsom reduceret enzymatisk aktivitet i de separerede proteiner 8 og Coomassie molekyle adduktdannelse, hvor sidstnævnte er meget skadelig for downstream MS-analyser 9. Begge disse metoder er imidlertid traditionelt forbundet med lav genopretning og smal proteomanalyse dækning på grund af farvning og gel udvinding begrænsninger 7.
Til studiet af denaturerede proteiner, er der flere teknikker, der opretholder makromolekyle opløselighed, mens de udfører høj opløsning fraktionering med højt proteinindhold genvinding og som er kompatible med diVerse post-separation protein analyseteknikker. Gel-Elueret flydende fraktion Entrapment Elektroforese (GELFrEE) er en af de fraktioneringsteknikker der passer alle disse egenskaber. Denne metode anvendes i vidt omfang i højt gennemløb top-down proteomics studier, hvilket indikerer, at den er hurtig og alsidig. I GELFrEE, proteiner denatureres og separerede baseret på molekylvægt gennem en rørformet gelmatrix, kan porøsiteten af hvilken varieres baseret på prøve krav og de ønskede fraktioneringstrin resultater. Fraktioner elueres i flydende fase, og dermed reducere de inddrivelsesprocedurer begrænsninger forbundet med SDS-PAGE og samtidig opretholde en høj opløsning. Fraktion alikvoter kan derefter analyseres ved 1-D PAGE for molekylvægt båndbreddevalg 11. Der er stor efterspørgsel efter de fordele, der er forbundet med GELFrEE i native separationsteknikker. Den her beskrevne metode, Clear Native GELFrEE (CN-GELFrEE), er en indfødt tilpasning af GELFrEE. For at være forenelig med en bred spectrum af makromolekyler i deres native tilstand, denne metode beror ikke blot på den bløde KN-PAGE kemi, men også på en porøsitet gradient separation, hvilket reducerer proteinpræcipitation ved at eliminere den barske overgang mellem porøsiteter stede i diskontinuerlige gelsystemer 9. Når den anvendes på fraktionere proteinkomplekser ekstraheret fra muse hjerte, eluerede fraktioner viste høj genvinding og en høj opløsning separation af en lang række molekylvægte blev opnået. Endvidere er de resulterende fraktioner er kompatible med de fleste nedstrøms biokemisk og biofysisk protein analyser.
Protocol
Representative Results
Discussion
CN-GELFrEE er afledt af den klare native (CN) PAGE buffer system, der bruger en blanding af anioniske og neutrale rengøringsmidler som bærermolekyler 9 til molekylær-vægtbaseret protein fraktionering gennem en gelmatrix. Anvendelsen af KN-GELFrEE til en indfødt mus hjerte proteinekstrakt genereret lav kompleksitet fraktioner med diskrete båndbredder samtidig bevare ikke-kovalente interaktioner af biomolekylære forsamlinger. Sammenligning af fraktioner mellem CN-PAGE og reducerende SDS-PAGE-pladeg…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
WM Keck Foundation generøst ydet støtte til dette arbejde. Dette materiale er baseret på arbejde støttet af FAPERJ forskningsbevilling 100,039 / 2014 fra regeringen i Rio de Janeiro – Brasilien for RDM, videnskab uden Grænser stipendium 88888,075416 / 2013-00 fra Koordinering til Forbedring af de videregående uddannelser Personale, under regeringens Brasilien, for HSS, National Science Foundation Graduate Research Fellowship under fællesskab nummer 2014171659 for OSS, og ved CNPq forskningsbevilling 202.011 / 2012-7 fra regeringen i Brasilien for LHFDVPCH er en modtager af en Northwestern Universitys kemi livsprocesser Institute Postdoc Fellowship Award.
Materials
| Reagents | |||
| 30% acrylamide/bis solution, 37.5:1 | Bio-Rad | 161-0158 | This solution is neurotoxic. |
| 6-aminohexanoic acid (ε-aminocaproic acid) | Sigma-Aldrich | A2504 | This chemical is an irritant. |
| Ammonium persulfate (APS) | Fisher Scientific | 7727-54-0 | This chemical is flammable, toxic, and corrosive. |
| Coomassie blue G250 | Bio-Rad | 161-0406 | |
| Dodecylmaltoside | Sigma-Aldrich | D4641 | This chemical is an irritant. |
| Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | FLUKA | 3777 | This chemical is toxic. |
| Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP120 | This chemical is toxic. |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Liquid nitrogen | Any supplier | n/a | Store liquid nitrogen in containers designed for low-temperature liquids |
| Mouse heart | Bioreclamation LLC | MSE-HEART | |
| n-butanol | Fisher Scientific | 71-36-3 | This chemical is flammable and toxic. |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | BP103 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Fisher Scientific | 78430 | This chemical is toxic. |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | This chemical is an irritant. |
| Sucrose | JTBaker | 4097 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-Rad | 161-0800 | This chemical flammable and irritant. |
| Tris-HCl | Amresco | M151 | |
| Trycine | Bio-Rad | 161-071 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Gradient mixer | Hoefer | SG15 | |
| Magnetic stir | Any supplier | n/a | |
| Magnetic bars | Any supplier | n/a | Small enough to fit inside the gradiet mixer chambers. |
| Power supply | Bio-Rad | 164-5056 | Voltage up to 1,500 V |
| Refrigerated centrifugue | Eppendorf | 022622552 | Up to 15,000 x g |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 15 mL conical tube | Any supplier | n/a | |
| 30-kDa-MWCO ultra centrifugal filter | Millipore | UFC503096 | |
| Flexible tubing | Saint-Gobain | B000FOV1J0 | Approximately 1 m length |
| Ice bucket | Any supplier | n/a | |
| Liquid/air metallic or plastic valve. (e.g. aquarium air/water flow control lever valve) | Any supplier | n/a | Aquarium valves are compatible. |
| Mortar and pestle | Any supplier | n/a | |
| Native PAGE 3-12% T slab gel | Invitrogen | BN1003 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-13 | |
| Protein low bind tube 1.5 mL | Eppendorf | 022431081 | |
| Razor blade | IDL Tools | TE05-091C | |
| Regenerated cellulose dialysis tubing 3,500 MWCO | Fisher Scientific | 21-152-9 | |
| SDS-PAGE slab gel for any kDa | Bio-Rad | 456-9036 | |
| Serological pipets (25 ml) | VWR | 89130-900 | |
| Syringe (10 ml) | Any supplier | n/a | |
Riferimenti
- Alberts, B. The Cell as a Collection of Protein Machines: Preparing the Next Generation of Molecular Biologists. Cell. 92 (3), 291-294 (1998).
- Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. Analysis of protein complexes using mass spectrometry. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (8), 645-654 (2007).
- Gavin, A. C., Bösche, M., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).
- Puig, O., Caspary, F., et al. The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Cremer, K. D., Hulle, M. V., et al. Fractionation of vanadium complexes in serum, packed cells and tissues of Wistar rats by means of gel filtration and anion-exchange chromatography. JBIC J. Biol. Inorg. Chem. 7 (7-8), 884-890 (2002).
- Tanese, N. Small-Scale Density Gradient Sedimentation to Separate and Analyze Multiprotein Complexes. Methods. 12 (3), 224-234 (1997).
- Bunai, K., Yamane, K. Effectiveness and limitation of two-dimensional gel electrophoresis in bacterial membrane protein proteomics and perspectives. J. Chromatogr. B. 815 (1-2), 227-236 (2005).
- Wittig, I., Schägger, H. Advantages and limitations of clear-native PAGE. PROTEOMICS. 5 (17), 4338-4346 (2005).
- Skinner, O. S., Do Vale, L. H. F., et al. Native GELFrEE: A New Separation Technique for Biomolecular Assemblies. Anal. Chem. 87 (5), 3032-3038 (2015).
- Nijtmans, L. G. J., Henderson, N. S., Holt, I. J. Blue Native electrophoresis to study mitochondrial and other protein complexes. Methods. 26 (4), 327-334 (2002).
- Tran, J. C., Doucette, A. A. Gel-Eluted Liquid Fraction Entrapment Electrophoresis: An Electrophoretic Method for Broad Molecular Weight Range Proteome Separation. Anal. Chem. 80 (5), 1568-1573 (2008).
- Smith, P. K., Krohn, R. I., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
