CN-GELFrEE - Clear india geleluiert flüssige Fraktion Verleitung Elektrophorese
Summary
This protocol describes how to prepare and perform clear native gel-eluted liquid fraction entrapment electrophoresis (CN-GELFrEE), a native separation technique for non-covalent biomolecular assemblies and proteins from heterogeneous samples that is compatible with various downstream protein analysis techniques.
Abstract
Protein-Komplexe führen eine Reihe von entscheidenden zellulären Funktionen. Aufklären ihre nicht-kovalente Wechselwirkungen und Dynamik ist von größter Bedeutung für das Verständnis der Rolle der Komplexe in biologischen Systemen. Während die direkte Charakterisierung biomolekularer Baugruppen zunehmend in den letzten Jahren an Bedeutung gewonnen hat, einheimische Fraktionierung Techniken, die mit Techniken Downstream-Analyse kompatibel sind, einschließlich der Massenspektrometrie, sind notwendig, um weiter diese Studien erweitern. Dennoch fehlt das Feld einen hohen Durchsatz, Weitbereichs, High-Recovery-Trennverfahren für native Protein Baugruppen. Hier präsentieren wir klare nativen geleluiert flüssige Fraktion Einklemmung Elektrophorese (CN-GELFrEE), das ist eine neue Trennmethode für nicht-kovalente Protein-Baugruppen. CN-GELFrEE Trennleistung wurde durch Fraktionierung Komplexe aus Mäuseherzen extrahiert demonstriert. Die Fraktionen wurden über 2 Stunden gesammelt und angezeigt im Bereich diskrete Banden von ~ 30 bis 500 kDa. A congängige Muster Molekulargewicht Bandbreiten der Erhöhung beobachtet, jeweils im Bereich ~ 100 kDa. Ferner zeigte anschließende Re-Analyse von nativen Fraktionen über SDS-PAGE Molekulargewicht mit der Denaturierung von Proteinkomplexen konsistent verschiebt. Daher wurde CN-GELFrEE erwies sich die Fähigkeit zur Durchführung hochauflösenden und hoch Recovery nativen Trennungen auf Proteinkomplexe aus einem großen Molekulargewichtsbereich zu bieten, Fraktionen bieten, die mit kompatibel sind Downstream-Protein analysiert.
Introduction
Der Großteil der biologischen Prozesse innerhalb einer Zelle passiert sind gedacht , durch Proteinanordnungen statt 1 einzelne Proteine durchgeführt werden. Folglich, um die spezifische biologische Rolle einer Protein – Untereinheit in einer Zelle zu erläutern ist es notwendig , seine strukturelle Wechselwirkungen mit anderen Proteinen oder Liganden in den Komplexen 2 zu verstehen. Allerdings Proteine nativ zu studieren, die Aufrechterhaltung ihrer nicht-kovalente Wechselwirkungen und Aktivität, bleibt eine Herausforderung. Einer der Nachteile von nativem Protein Studien ist eine geeignete einheimische Trenntechnik, die mit verschiedenen Downstream-Protein-Analyse-Techniken kompatibel ist. Aus diesem Grund hat scharf 3 aktuelle Interesse an der Trenntechniken fähig zur Charakterisierung nicht-kovalente Baugruppen von Biomolekülen erhöht.
Protein-Trenntechniken sind unerlässlich, Biochemie, Biophysik und verschiedene andere Studien. Aktuelle nativen Trenntechniken haben intrinsic Mängel, die die Kompatibilität mit Downstream-Analysen, wie niedrige Auflösung, geringem Durchsatz, Verlust an Niederschlag, und die Anforderung von großen Mengen an Ausgangsprobe zu reduzieren. Tandem Affinitätsreinigung wird für die Proteininteraktionsstudien allgemein verwendet, aber es muss separat für jedes Protein Target durchgeführt, wodurch es 4 inkompatibel mit Hochdurchsatz – Analyse. Grßenausschlußchromatographie 5, selektive Fällung mit Ionen – Affinitätschromatographie 5 und Dichtegradienttrennmittel 6 alle nativen Trennungen zur Verfügung gestellt haben, sind aber von Natur aus niedrig auflösenden Techniken und erfordern hohe Anfangsprobenmengen.
Alternativ Gelbasis Techniken, wie Blue Native (BN) und Clear Native (CN) PAGE (entweder 1-D oder 2-D), zeigen hochauflösende Trennung. Darüber hinaus im Gegensatz zu anderen Techniken erwähnt, beide native PAGE Trennungen halten Löslichkeit und nativer Konformation eines breiten range von Makromolekül-Spezies, einschließlich hydrophobe Proteine. Diese Fähigkeit erweitert ferner die Proteom Abdeckung durch diese Verfahren erreicht 7,8 und wird durch unterschiedliche Chemie zwischen CN und BN-PAGE erreicht. CN-PAGE setzt häufig auf weichen geladene Reinigungsmittel als Trägermoleküle, die Coomassie-Blau-Farbstoff in BN-PAGE zu ersetzen. BN-PAGE, wenn auch mit einer höheren Auflösung verbunden sind , hat Vorbehalte wie reduzierte enzymatische Aktivität in den getrennten Proteine 8 und Adduktbildung Coomassie Molekül, wobei letztere stark abträglich nachgelagerten MS wird analysiert 9. Beide Verfahren sind traditionell jedoch in Verbindung mit niedrigen Erholung und schmalen Proteom Abdeckung aufgrund der Färbung und -Gelextraktions Einschränkungen 7.
Für die Studie von denaturierten Proteinen, gibt es mehrere Techniken, die Makro Löslichkeit aufrechtzuerhalten, während hochauflösende Fraktionierung mit hohem Proteinwiederherstellung durchführen und dass sind kompatibel mit diVerse Nachabscheidung Proteinanalysetechniken. Geleluiert flüssige Fraktion Entrapment Electrophoresis (GELFrEE) ist eine der Fraktionierungstechniken, die alle diese Eigenschaften passen. Dieses Verfahren wird in Hochdurchsatz-top-down Proteomstudien weitgehend angewendet, was darauf hinweist, dass es schnell und vielseitig ist. In GELFrEE, Proteine denaturiert und getrennt werden bezogen auf das Molekulargewicht durch eine röhrenförmige Gel-Matrix kann die Porosität von denen basierend auf Probe Anforderungen und den gewünschten Fraktionierung Ergebnisse variiert werden. Die Fraktionen werden in der flüssigen Phase eluiert, wodurch die Erholung Einschränkungen reduziert mit SDS-PAGE assoziiert, während eine hohe Auflösung. Die Fraktion Aliquots können dann durch 1-D PAGE für Molekulargewicht Bandbreite Auswahl 11 analysiert werden. Es besteht eine hohe Nachfrage nach den mit GELFrEE verbundenen Vorteile in nativen Trenntechniken. Das hier beschriebene Verfahren, löschen Mutter GELFrEE (CN-GELFrEE), ist eine native Bearbeitung von GELFrEE. Um mit einem breiten s kompatibel zu seinpectrum von Makromolekülen in ihrem nativen Zustand stützt sich dieses Verfahren nicht nur auf dem weichen CN-PAGE Chemie, sondern auch auf einem Porositätsgradienten Trennung, die durch Eliminieren des harten Übergang zwischen Porositäten in diskontinuierlichen Gelsystemen 9 Proteinpräzipitation reduziert. Bei Anwendung auf Proteinkomplexe, extrahiert aus Maus Herz fraktionieren, angezeigt eluierten Fraktionen hohe Rückgewinnung und eine hochauflösende Trennung von einem breiten Bereich von Molekulargewichten erhalten wurde. Ferner sind die resultierenden Fraktionen kompatibel mit den meisten nachgelagerten biochemischen und biophysikalischen Protein analysiert.
Protocol
Representative Results
Discussion
CN-GELFrEE wird aus der klaren Mutter (CN) PAGE – Puffersystem abgeleitet , die eine Mischung aus anionischen und neutralen Reinigungsmitteln als Trägermoleküle 9 für molekulargewichtsabhängige Proteinfraktionierung durch eine Gelmatrix verwendet. Die Anwendung des CN-GELFrEE zu einer nativen Maus Herz Proteinextrakt erzeugt geringe Komplexität Fraktionen mit diskreten Bandbreiten unter Beibehaltung nicht-kovalente Wechselwirkungen von Biomolekülen Baugruppen. Vergleich der Fraktionen zwischen CN-PAGE u…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die WM Keck-Stiftung großzügig Mittel für diese Arbeit. Dieses Material basiert auf der Arbeit von Grant FAPERJ Forschung unterstützt 100,039 / 2014 von der Regierung von Bundesstaat Rio de Janeiro – Brasilien für RDM, Wissenschaft ohne Grenzen Stipendium 88888,075416 / 2013-00 von der Koordination zur Verbesserung der Hochschulpersonal, unter der Regierung die National Science Foundation Graduate Research Fellowship unter Kameradschaft Nummer 2014171659 für OSS und durch CNPq Forschungsstipendium 202011 / 2012-7 von der Regierung von Brasilien für LHFDVPCH von Brasilien, für HSS, ist ein Empfänger einer der Northwestern University Chemie der Lebensprozesse Institut Postdoctoral Fellowship Award.
Materials
| Reagents | |||
| 30% acrylamide/bis solution, 37.5:1 | Bio-Rad | 161-0158 | This solution is neurotoxic. |
| 6-aminohexanoic acid (ε-aminocaproic acid) | Sigma-Aldrich | A2504 | This chemical is an irritant. |
| Ammonium persulfate (APS) | Fisher Scientific | 7727-54-0 | This chemical is flammable, toxic, and corrosive. |
| Coomassie blue G250 | Bio-Rad | 161-0406 | |
| Dodecylmaltoside | Sigma-Aldrich | D4641 | This chemical is an irritant. |
| Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | FLUKA | 3777 | This chemical is toxic. |
| Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP120 | This chemical is toxic. |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Liquid nitrogen | Any supplier | n/a | Store liquid nitrogen in containers designed for low-temperature liquids |
| Mouse heart | Bioreclamation LLC | MSE-HEART | |
| n-butanol | Fisher Scientific | 71-36-3 | This chemical is flammable and toxic. |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | BP103 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Fisher Scientific | 78430 | This chemical is toxic. |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | This chemical is an irritant. |
| Sucrose | JTBaker | 4097 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-Rad | 161-0800 | This chemical flammable and irritant. |
| Tris-HCl | Amresco | M151 | |
| Trycine | Bio-Rad | 161-071 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Gradient mixer | Hoefer | SG15 | |
| Magnetic stir | Any supplier | n/a | |
| Magnetic bars | Any supplier | n/a | Small enough to fit inside the gradiet mixer chambers. |
| Power supply | Bio-Rad | 164-5056 | Voltage up to 1,500 V |
| Refrigerated centrifugue | Eppendorf | 022622552 | Up to 15,000 x g |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 15 mL conical tube | Any supplier | n/a | |
| 30-kDa-MWCO ultra centrifugal filter | Millipore | UFC503096 | |
| Flexible tubing | Saint-Gobain | B000FOV1J0 | Approximately 1 m length |
| Ice bucket | Any supplier | n/a | |
| Liquid/air metallic or plastic valve. (e.g. aquarium air/water flow control lever valve) | Any supplier | n/a | Aquarium valves are compatible. |
| Mortar and pestle | Any supplier | n/a | |
| Native PAGE 3-12% T slab gel | Invitrogen | BN1003 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-13 | |
| Protein low bind tube 1.5 mL | Eppendorf | 022431081 | |
| Razor blade | IDL Tools | TE05-091C | |
| Regenerated cellulose dialysis tubing 3,500 MWCO | Fisher Scientific | 21-152-9 | |
| SDS-PAGE slab gel for any kDa | Bio-Rad | 456-9036 | |
| Serological pipets (25 ml) | VWR | 89130-900 | |
| Syringe (10 ml) | Any supplier | n/a | |
Riferimenti
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