CN-GELFrEE - Clear nativo Gel-eluito Frazione Liquid Entrapment elettroforesi
Summary
This protocol describes how to prepare and perform clear native gel-eluted liquid fraction entrapment electrophoresis (CN-GELFrEE), a native separation technique for non-covalent biomolecular assemblies and proteins from heterogeneous samples that is compatible with various downstream protein analysis techniques.
Abstract
complessi proteici svolgono una serie di funzioni cellulari cruciali. Chiarire le loro interazioni non covalenti e la dinamica è fondamentale per la comprensione del ruolo di complessi nei sistemi biologici. Mentre la caratterizzazione diretta di complessi biomolecolari è diventato sempre più importante negli ultimi anni, le tecniche di frazionamento nativi che sono compatibili con le tecniche di analisi a valle, tra la spettrometria di massa, sono necessari per espandere ulteriormente questi studi. Tuttavia, il campo manca di un high-throughput, ad ampio spettro, metodo di separazione ad alta recupero per gli assembly proteina nativa. Qui, presentiamo chiaro nativo frazione liquida gel-elettroforesi eluita intrappolamento (CN-GELFrEE), che è una modalità di separazione nuovo per assiemi proteici non covalenti. prestazioni di separazione CN-GELFrEE è stata dimostrata da complessi di frazionamento estratte dal cuore del mouse. Le frazioni sono state raccolte più di 2 ore e visualizzati bande discrete che vanno da ~ 30 a 500 kDa. A conè stata osservata modello coerente di aumentare larghezze di banda di peso molecolare, ciascuno compreso ~ 100 kDa. Inoltre, la successiva rianalisi delle frazioni native tramite SDS-PAGE ha mostrato peso molecolare sposta coerente con la denaturazione di complessi proteici. Pertanto, CN-GELFrEE stato dimostrato di offrire la possibilità di eseguire ad alta risoluzione e ad alta recupero separazioni native su complessi proteici da un ampio intervallo di peso molecolare, fornendo frazioni compatibili con analisi di proteine a valle.
Introduction
La maggior parte dei processi biologici che accadono all'interno di una cella si pensa siano svolte da gruppi di proteine piuttosto che singole proteine 1. Di conseguenza, al fine di chiarire il ruolo biologico specifico di una subunità della proteina in una cellula è necessario comprenderne le interazioni strutturali con altre proteine o leganti in complessi 2. Tuttavia, lo studio delle proteine in modo nativo, mantenendo le loro interazioni e le attività non covalenti, rimane difficile. Uno dei difetti di studi proteina nativa è una tecnica di separazione adeguato nativa che è compatibile con varie tecniche di analisi delle proteine a valle. Pertanto, il recente interesse per le tecniche di separazione in grado di caratterizzare le assemblee non covalenti di biomolecole è aumentato bruscamente 3.
tecniche di separazione delle proteine sono indispensabili per la biochimica, biofisica e vari altri studi. Attuali tecniche di separazione nativi hanno intrinsic carenze che riducono la compatibilità con le analisi a valle, come la bassa risoluzione, bassa produttività, perdita di precipitazioni, e l'esigenza di grandi quantità di campione iniziale. Tandem purificazione di affinità è comunemente utilizzato per gli studi di interazione proteina, ma deve essere effettuata separatamente per ciascun target di proteine, causando che sia incompatibile con l'analisi high-throughput 4. Dimensioni cromatografia di esclusione 5, precipitazione selettiva con lo ione cromatografia di affinità 5 e in gradiente di densità separazione 6 tutti hanno fornito le separazioni nativi, ma sono intrinsecamente tecniche a bassa risoluzione e richiedono elevate quantità di campione iniziale.
In alternativa, le tecniche di gel a base, come il blu Native (BN) e Clear Native PAGE (CN) (sia 1-D o 2-D), mostrano la separazione ad alta risoluzione. Inoltre, in contrasto con altre tecniche menzionate, sia le separazioni PAGE nativi mantengono solubilità e conformazione nativa di un'ampia range di specie macromolecola, tra cui proteine idrofobiche. Questa funzionalità amplia ulteriormente la copertura proteoma raggiunta da questi metodi 7,8 e si ottiene attraverso diversi chimica tra CN e BN-PAGE. CN-PAGE si basa comunemente sui detergenti morbido pagano come molecole carrier, sostituendo il colorante Coomassie Blu di BN-PAGE. BN-PAGE, anche se associata a maggiore risoluzione, ha avvertimenti come ridotta attività enzimatica delle proteine separate 8 e formazione di addotti Coomassie molecola, quest'ultimo essendo notevolmente pregiudizievoli per MS valle analisi 9. Entrambi questi metodi, tuttavia, sono tradizionalmente associati a bassa recupero e la copertura proteoma stretta a causa di macchie e le limitazioni di estrazione gel 7.
Per lo studio di proteine denaturate, ci sono diverse tecniche che mantengono macromolecola solubilità durante l'esecuzione di frazionamento ad alta risoluzione con recupero ad alto contenuto proteico e che sono compatibili con diVerse tecniche di analisi delle proteine post-separazione. Gel-eluite frazione liquida Entrapment elettroforesi (GELFrEE) è una delle tecniche di frazionamento che si adattano tutte queste caratteristiche. Questo metodo è ampiamente applicata in studi high-throughput proteomica top-down, che indica che è veloce e versatile. In GELFrEE, le proteine vengono denaturate e separate in base al peso molecolare attraverso una matrice tubolare di gel, la cui porosità può essere variata in base alle esigenze di esempio ei risultati frazionamento desiderati. Le frazioni eluite sono in fase liquida, riducendo così le limitazioni ripristino associati con SDS-PAGE mantenendo alta risoluzione. Aliquote frazione può poi essere analizzati da 1-D PAGE per peso molecolare selezione della larghezza di banda 11. C'è forte domanda per i vantaggi connessi con GELFrEE in tecniche di separazione nativi. Il metodo descritto nel presente documento, Cancella Native GELFrEE (CN-GELFrEE), è un adattamento nativo di GELFrEE. Per essere compatibile con un'ampia spectrum di macromolecole nel loro stato nativo, questo metodo si basa non solo sul morbido chimica CN-PAGE, ma anche sulla separazione di porosità pendenza, che riduce la precipitazione delle proteine eliminando la dura transizione tra porosità presenti nei sistemi gel discontinui 9. Quando viene applicato a frazionare complessi proteici estratti dal cuore del mouse, frazioni eluite visualizzati elevato recupero e la separazione ad alta risoluzione di una vasta gamma di pesi molecolari è stato ottenuto. Inoltre, le frazioni risultanti sono compatibili con la maggior parte analizza valle proteine biochimica e biofisica.
Protocol
Representative Results
Discussion
CN-GELFrEE deriva dal sistema tampone PAGE nativa chiaro (CN) che utilizza una miscela di tensioattivi anionici e detergenti neutri come molecole carrier 9 per frazionamento proteico e peso molecolare attraverso una matrice di gel. L'applicazione di CN-GELFrEE ad un estratto nativo proteina cuore del mouse generato frazioni bassa complessità con larghezze di banda discreti, pur mantenendo le interazioni non covalenti delle assemblee biomolecolari. Confronto di frazioni tra CN-PAGE e riducendo gel lastra …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il WM Keck Foundation generosamente fornito finanziamenti per questo lavoro. Questo materiale si basa su lavoro sostenuto da FAPERJ Research Grant 100,039 / 2014 da parte del governo di Rio de Janeiro – Brasile per RDM, Scienza Senza Frontiere borsa 88.888,075,416 mila / 2013-00 dal Coordinamento per il miglioramento delle Higher Education personale, sotto il governo del Brasile, per HSS, la National Science Foundation Graduate Research Fellowship con il numero 2014171659 comunione per OSS, e CNPq Research grant 202011 / 2012-7 da parte del governo del Brasile per LHFDVPCH è un destinatario di chimica della vita di una Università Northwestern Processi Istituto Postdoctoral Premio Fellowship.
Materials
| Reagents | |||
| 30% acrylamide/bis solution, 37.5:1 | Bio-Rad | 161-0158 | This solution is neurotoxic. |
| 6-aminohexanoic acid (ε-aminocaproic acid) | Sigma-Aldrich | A2504 | This chemical is an irritant. |
| Ammonium persulfate (APS) | Fisher Scientific | 7727-54-0 | This chemical is flammable, toxic, and corrosive. |
| Coomassie blue G250 | Bio-Rad | 161-0406 | |
| Dodecylmaltoside | Sigma-Aldrich | D4641 | This chemical is an irritant. |
| Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | FLUKA | 3777 | This chemical is toxic. |
| Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP120 | This chemical is toxic. |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Liquid nitrogen | Any supplier | n/a | Store liquid nitrogen in containers designed for low-temperature liquids |
| Mouse heart | Bioreclamation LLC | MSE-HEART | |
| n-butanol | Fisher Scientific | 71-36-3 | This chemical is flammable and toxic. |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | BP103 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Fisher Scientific | 78430 | This chemical is toxic. |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | This chemical is an irritant. |
| Sucrose | JTBaker | 4097 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-Rad | 161-0800 | This chemical flammable and irritant. |
| Tris-HCl | Amresco | M151 | |
| Trycine | Bio-Rad | 161-071 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Gradient mixer | Hoefer | SG15 | |
| Magnetic stir | Any supplier | n/a | |
| Magnetic bars | Any supplier | n/a | Small enough to fit inside the gradiet mixer chambers. |
| Power supply | Bio-Rad | 164-5056 | Voltage up to 1,500 V |
| Refrigerated centrifugue | Eppendorf | 022622552 | Up to 15,000 x g |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 15 mL conical tube | Any supplier | n/a | |
| 30-kDa-MWCO ultra centrifugal filter | Millipore | UFC503096 | |
| Flexible tubing | Saint-Gobain | B000FOV1J0 | Approximately 1 m length |
| Ice bucket | Any supplier | n/a | |
| Liquid/air metallic or plastic valve. (e.g. aquarium air/water flow control lever valve) | Any supplier | n/a | Aquarium valves are compatible. |
| Mortar and pestle | Any supplier | n/a | |
| Native PAGE 3-12% T slab gel | Invitrogen | BN1003 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-13 | |
| Protein low bind tube 1.5 mL | Eppendorf | 022431081 | |
| Razor blade | IDL Tools | TE05-091C | |
| Regenerated cellulose dialysis tubing 3,500 MWCO | Fisher Scientific | 21-152-9 | |
| SDS-PAGE slab gel for any kDa | Bio-Rad | 456-9036 | |
| Serological pipets (25 ml) | VWR | 89130-900 | |
| Syringe (10 ml) | Any supplier | n/a | |
Riferimenti
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