CN-GELFrEE - 지우기 기본 젤 - 용출 액체 분수 내포 전기 영동
Summary
This protocol describes how to prepare and perform clear native gel-eluted liquid fraction entrapment electrophoresis (CN-GELFrEE), a native separation technique for non-covalent biomolecular assemblies and proteins from heterogeneous samples that is compatible with various downstream protein analysis techniques.
Abstract
단백질 복합체는 중요한 세포 기능의 배열을 수행한다. 자신의 비공유 상호 작용과 역 동성을 해명하는 것은 생물학적 시스템에서 단지의 역할을 이해하는 데 중요합니다. 생체 분자 어셈블리 직접 특성화 최근 점점 더 중요 해지고 있지만, 질량 분석법을 포함한 다운 스트림 분석 기술과 호환되는 기본 분류 기술은 더욱 이러한 연구를 확장 할 필요가있다. 그럼에도 불구하고, 필드는 천연 단백질 어셈블리에 대한 높은 처리량, 넓은 범위의 높은 회수 분리 방법이 부족하다. 여기서는 비공유 단백질 어셈블리 신규 분리 양상을 분명히 네이티브 겔 용출 액체 분획 포착 전기 (CN-GELFrEE)를 제시한다. CN-GELFrEE 분리 성능은 마우스 마음에서 추출 분획 복합체에 의해 입증되었다. 분수는 2 시간에 걸쳐 수집 ~ 30에서 500 kDa의에 이르기까지 개별 밴드를 표시했다. 콘분자량의 대역폭을 증가시키는 일관된 패턴은 각각 ~ 100 kDa의 범위를 관찰 하였다. 또한, SDS-PAGE를 통해 네이티브 분획 후의 재분석 분자량 단백질 복합체의 변성과 일치 이동 하였다. 따라서, CN-GELFrEE 하류 단백질 분석과 호환되는 분획을 제공하는 넓은 분자량 범위에서 단백질 복합체의 고해상도 및 높은 회복 네이티브 분리를 수행 할 수있는 능력을 제공하는 것으로 판명되었다.
Introduction
셀 내에서 일어나고있는 생물학적 과정의 대부분은 단백질 어셈블리보다는 단일 단백질 (1)에 의해 수행 될 것으로 생각된다. 결과적으로, 셀의 서브 유닛 단백질의 특정 생물학적 역할을 규명하기 위하여는 단지이 다른 단백질 또는 리간드와의 상호 작용의 구조를 이해하는 것이 필요하다. 그러나, 그들의 비공유 상호 작용과 활동을 유지, 기본적으로 단백질을 공부하고, 도전 남아있다. 천연 단백질 연구의 단점 중 하나는 다양한 하류 단백질 분석 기술과 호환되는 적절한 원시 분리 기술이다. 따라서, 생체의 비공유 어셈블리를 특성화 할 수있는 분리 기술에 대한 관심은 최근에 급격히 증가하고있다 (3).
단백질 분리 기술은 생화학, 생물 물리학 등 다양한 연구하는 것이 필수적이다. 현재 기본 분리 기술을 intrinsi낮은 해상도, 낮은 처리량, 강수량 감소, 초기 샘플 많은 양의 요구 사항으로 다운 스트림 분석, 호환성을 줄일 C 결핍. 탠덤 친 화성 정제는 일반적으로 단백질 상호 작용 연구를 위해 사용되지만, 그것은 높은 처리량 분석 4와 호환되도록한다 각 단백질 타겟에 대해 개별적으로 수행되어야한다. 크기 배제 크로마토 그래피 (5) 모두 기본 분리를 제공하지만, 본질적으로 저해상도 기술이며 높은 초기 샘플 량을 필요로 한 이온 친 화성 크로마토 그래피 (5) 밀도 구배 분리 6 선택적 침전.
대안 적으로, 청색 기본 (BN) 및 클리어 네이티브 (CN)과 같은 PAGE 겔 기반 기술 (중 1-D 또는 2-D)는, 고해상도의 분리를 표시. 또한, 다른 기술이 언급 대조, 네이티브 PAGE 분리는 광범위한 연구의 용해도 및 기본 형태를 유지소수성 단백질을 포함하는 고분자 종의 플랜지. 이 기능은 또한 이러한 방법 7,8에 의해 도달 프로테옴 범위를 넓혀 및 CN 및 BN-PAGE 사이에 다른 화학을 통해 달성된다. CN-PAGE는 일반적으로 BN-PAGE에서 쿠마 파란색 염료를 대체 캐리어 분자 소프트 충전 세제를 사용합니다. 높은 해상도와 관련된 있지만 BN-PAGE는 이러한 분리 된 단백질 8 쿠마 분자 부가 형성의 감소 효소 활성,이 후자의 다운 스트림 MS에 크게 편파적 인 9를 분석 같은주의 사항이 있습니다. 이 두 가지 방법은, 그러나, 전통적으로 인해 염색 및 젤 추출 제한 7을 둘러 복구 및 좁은 프로테옴 범위와 관련이있다.
변성 된 단백질의 연구를 위해이 높은 단백질 회복 고해상도 분별을 행하면서 고분자의 용해도를 유지 몇몇 기술은 다음과 그 D와 호환분리 후 단백질 분석 기술을 iverse. 젤 – 용출 액체 분수 내포 전기 영동 (GELFrEE)는 모든 이러한 특성에 맞게 분류 기법 중 하나입니다. 이 방법은 대부분이 신속하고 다목적 인 것을 나타내는, 높은 처리량 하향식 프로테오믹스 연구에 적용된다. GELFrEE에서 단백질이 변성되고 관형 겔 매트릭스를 통해 분자량에 기초한 분리의 기공율은 샘플 요건 및 원하는 분류 결과에 기초하여 변화 될 수있다. 분획 따라서 고해상도를 유지하면서, SDS-PAGE와 연관된 회수 제한을 감소 액상으로 용출된다. 분획 분액 후 분자량 대역폭 선택 (11) 1-D의 PAGE에 의해 분석 될 수있다. 기본 분리 기술에 GELFrEE과 관련된 이점에 대한 수요가있다. 본원에 기재된 방법은, 클리어 네이티브 GELFrEE (CN-GELFrEE)는 GELFrEE의 네이티브 적응된다. 위해 폭 넓은들과 호환 가능합니다그 나라의 상태에서 거대 분자의 pectrum,이 방법은 소프트 CN-PAGE 화학에뿐만 아니라 불연속 겔 시스템 (9)에 존재하는 다공성의 거친 전환을 제거하여 단백질 침전을 감소 다공성 기울기 분리에뿐만 아니라 의존한다. 마우스의 심장으로부터 추출 된 단백질 복합체를 분별에 적용될 때, 용출 된 분획을 회수하고 높은 얻었다 광범위한 분자량 고해상도 분리 표시. 또한, 얻어진 분획 하류 생화학 및 생물 물리학 적 단백질 분석 대부분 호환된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
CN-GELFrEE은 겔 매트릭스를 통해 분자량 계 단백질 분획에 대한 담체 분자 9 음이온 성 및 중성 세제의 혼합물을 사용하여 클리어 네이티브 (CN) 페이지 버퍼 시스템으로부터 유도된다. 네이티브 마우스 심장 단백질 추출물 CN-GELFrEE의 애플리케이션 생체 분자 어셈블리의 비공유 상호 작용을 유지하면서, 이산 대역폭과 낮은 복잡도 분획 생성. CN-PAGE 및 SDS-PAGE 환원 슬랩 겔 분획 사이의 비교 ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
WM 켁 재단은 관대하게이 일을 위해 자금을 제공했다. 정부에서, 고등 교육 인력의 개선을 위해 조정에서 테두리 장학금 88888.075416 / 2013-00없이 RDM 브라질, 과학 – 본 자료는 리오 데 자네이로 국가의 정부로부터 FAPERJ 연구 보조금 100.039 / 2014 지원 작업을 기반으로 브라질의, HSS를 들면, 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 대학원 연구 OSS에 대한 교제 번호 2014171659에서 친목 및 CNPq 연구 보조금 LHFDVPCH에 대한 브라질 정부의 202,011 / 2012-7에 의해 생명의 노스 웨스턴 대학의 화학받는 사람은 연구소 박사후을 처리하다 원정대 수상.
Materials
| Reagents | |||
| 30% acrylamide/bis solution, 37.5:1 | Bio-Rad | 161-0158 | This solution is neurotoxic. |
| 6-aminohexanoic acid (ε-aminocaproic acid) | Sigma-Aldrich | A2504 | This chemical is an irritant. |
| Ammonium persulfate (APS) | Fisher Scientific | 7727-54-0 | This chemical is flammable, toxic, and corrosive. |
| Coomassie blue G250 | Bio-Rad | 161-0406 | |
| Dodecylmaltoside | Sigma-Aldrich | D4641 | This chemical is an irritant. |
| Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | FLUKA | 3777 | This chemical is toxic. |
| Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP120 | This chemical is toxic. |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Liquid nitrogen | Any supplier | n/a | Store liquid nitrogen in containers designed for low-temperature liquids |
| Mouse heart | Bioreclamation LLC | MSE-HEART | |
| n-butanol | Fisher Scientific | 71-36-3 | This chemical is flammable and toxic. |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | BP103 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Fisher Scientific | 78430 | This chemical is toxic. |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | This chemical is an irritant. |
| Sucrose | JTBaker | 4097 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-Rad | 161-0800 | This chemical flammable and irritant. |
| Tris-HCl | Amresco | M151 | |
| Trycine | Bio-Rad | 161-071 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Gradient mixer | Hoefer | SG15 | |
| Magnetic stir | Any supplier | n/a | |
| Magnetic bars | Any supplier | n/a | Small enough to fit inside the gradiet mixer chambers. |
| Power supply | Bio-Rad | 164-5056 | Voltage up to 1,500 V |
| Refrigerated centrifugue | Eppendorf | 022622552 | Up to 15,000 x g |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 15 mL conical tube | Any supplier | n/a | |
| 30-kDa-MWCO ultra centrifugal filter | Millipore | UFC503096 | |
| Flexible tubing | Saint-Gobain | B000FOV1J0 | Approximately 1 m length |
| Ice bucket | Any supplier | n/a | |
| Liquid/air metallic or plastic valve. (e.g. aquarium air/water flow control lever valve) | Any supplier | n/a | Aquarium valves are compatible. |
| Mortar and pestle | Any supplier | n/a | |
| Native PAGE 3-12% T slab gel | Invitrogen | BN1003 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-13 | |
| Protein low bind tube 1.5 mL | Eppendorf | 022431081 | |
| Razor blade | IDL Tools | TE05-091C | |
| Regenerated cellulose dialysis tubing 3,500 MWCO | Fisher Scientific | 21-152-9 | |
| SDS-PAGE slab gel for any kDa | Bio-Rad | 456-9036 | |
| Serological pipets (25 ml) | VWR | 89130-900 | |
| Syringe (10 ml) | Any supplier | n/a | |
Riferimenti
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- Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. Analysis of protein complexes using mass spectrometry. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (8), 645-654 (2007).
- Gavin, A. C., Bösche, M., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).
- Puig, O., Caspary, F., et al. The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Cremer, K. D., Hulle, M. V., et al. Fractionation of vanadium complexes in serum, packed cells and tissues of Wistar rats by means of gel filtration and anion-exchange chromatography. JBIC J. Biol. Inorg. Chem. 7 (7-8), 884-890 (2002).
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- Smith, P. K., Krohn, R. I., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
