CN-GELFrEE - Clear Native Gel-elueres flytende fraksjon Entrapment Elektroforese
Summary
This protocol describes how to prepare and perform clear native gel-eluted liquid fraction entrapment electrophoresis (CN-GELFrEE), a native separation technique for non-covalent biomolecular assemblies and proteins from heterogeneous samples that is compatible with various downstream protein analysis techniques.
Abstract
Proteinkomplekser utføre en rekke viktige cellulære funksjoner. Belyse sine ikke-kovalente interaksjoner og dynamikk er avgjørende for å forstå rollen av komplekser i biologiske systemer. Mens den direkte karakterisering av biomolekylære sammenstillingene har blitt stadig viktigere i de senere år, innfødte fraksjoneringsteknikker som er kompatible med nedstrømsanalyseteknikker, inkludert massespektroskopi, er nødvendig for å utvide disse studiene. Likevel mangler innen en høy gjennomstrømming, bredt spekter av høy utvinningsseparasjonsmetode for native protein forsamlinger. Her presenterer vi klare innfødte gel-elueres væskefraksjon entrapment elektroforese (CN-GELFrEE), som er en ny separasjon modalitet for ikke-kovalente protein forsamlinger. CN-GELFrEE separasjon ytelse ble demonstrert ved fraksjone komplekser hentet fra mus hjerte. Fraksjoner ble samlet inn over 2 timer og vises diskret band som spenner fra ~ 30-500 kDa. En conkonsistent mønster med økende molekylvekt båndbredder ble observert, som hver strekker seg ~ 100 kDa. Videre, etterfølgende ny analyse av innfødte fraksjoner via SDS-PAGE viste molekylvekten forskyver forenlig med denaturering av proteinkomplekser. Derfor ble CN-GELFrEE viste seg å tilby muligheten til å utføre høy oppløsning og høy-utvinning innfødte separasjoner på protein komplekser fra et stort molekylvekt i området, noe som gir fraksjoner som er kompatible med nedstrøms protein analyser.
Introduction
Flertallet av biologiske prosesser som skjer i en celle er tenkt å være utført av protein sammenstillinger i stedet for enkle proteiner 1. Følgelig, for å belyse den spesifikke biologiske rolle av et protein-subenhet i en celle er det nødvendig å forstå de strukturelle interaksjoner med andre proteiner eller ligander i komplekser 2. Men studerer proteiner opprinnelig, opprettholde sine ikke-kovalente interaksjoner og aktivitet, er fortsatt utfordrende. En av manglene ved native protein studier er en egnet innfødt separasjonsteknikk som er kompatibel med ulike nedstrøms proteinanalyseteknikker. Derfor har nylig interesse for separasjonsteknikker som kan karakterisere ikke-kovalente forsamlinger av biomolekyler økt kraftig tre.
Protein separasjonsteknikker er viktig å biokjemi, biofysikk og diverse andre studier. Nåværende innfødte separasjonsteknikker har intrinsic mangler som reduserer kompatibilitet med nedstrøms-analyser, slik som lav oppløsning, lav gjennomstrømning, tap til utfelling, og kravet om store mengder opprinnelige prøve. Tandem affinitet rensing er ofte brukt for protein interaksjonsstudier, men det må utføres separat for hvert protein mål, slik at det å være uforenlig med høy gjennomstrømming analyse fire. Størrelse kromatografi 5, selektiv utfelling med ion affinitet kromatografi 5 og tetthet-gradient separasjon 6 alle har gitt innfødte separasjoner, men er iboende lav oppløsning teknikker og krever høye startprøve beløp.
Alternativt kan gel-baserte teknikker, for eksempel blå Native (BN) og Clear Native (CN) PAGE (enten 1-D eller 2-D), viser høy oppløsning separasjon. Videre, i kontrast til andre teknikker nevnt, både innfødte HOVED separasjoner opprettholde løselighet og native konformasjon av en bred range av makromolekyl arter, inkludert hydrofobe proteiner. Denne funksjonen utvider ytterligere proteomet dekning nås med disse metodene 7,8 og oppnås gjennom ulike kjemi mellom CN og BN-PAGE. CN-PAGE ofte er avhengig av myk ladede vaskemidler som bærermolekyler, og erstatte den Coomassie blå fargestoffet i BN-PAGE. BN-PAGE, selv om forbundet med høyere oppløsning, har begrensninger som redusert enzymaktivitet i de utskilte proteiner 8 og Coomassie molekyl adduktdannelse, sistnevnte er sterkt skadelig for nedstrøms MS analyser 9. Begge disse metodene, men er tradisjonelt forbundet med lav utvinning og smal proteom dekning på grunn av flekker og gel utvinning begrensninger 7.
For studiet av denaturerte proteiner, er det flere teknikker som opprettholder oppløselighet makromolekyl ved utføring av høy oppløsning fraksjonering med høyt proteingjenvinning, og som er kompatible med diverse post-separasjon protein analyseteknikker. Gel-eluert flytende fraksjon Inneslut Elektroforese (GELFrEE) er en av de fraksjoneringsteknikker som passer alle disse egenskapene. Denne fremgangsmåte er i stor grad brukt i high-throughput top-down proteomics studier indikerer at det er raskt og allsidig. I GELFrEE, proteiner denatureres og separert på grunnlag av molekylvekt gjennom en rørformet gelmatrise, kan porøsiteten som varieres basert på eksempel krav og de ønskede fraksjoneringsresultatene. Fraksjonene eluert i væskefase, og dermed redusere de begrensninger som er forbundet med gjenvinning av SDS-PAGE og samtidig opprettholde høy oppløsning. Brøk porsjoner kan deretter bli analysert av en-D PAGE for molekylær-vekt båndbredde valg 11. Det er stor etterspørsel etter fordelene forbundet med GELFrEE i native separasjonsteknikker. Metoden er beskrevet her, Clear Native GELFrEE (CN-GELFrEE), er opprinnelig tilpasning av GELFrEE. For å være forenlig med en bred spectrum av makromolekyler i sin naturlige tilstand, er avhengig av denne fremgangsmåte ikke bare på den myke CN-PAGE kjemi, men også på en porøsitet gradient separasjon, noe som reduserer proteinutfelling ved å eliminere den harde overgangen mellom porøsiteter som er tilstede i diskontinuerlige gelsystemer 9. Når anvendt for å fraksjonere proteinkomplekser ekstrahert fra mus hjerte, eluerte fraksjoner viste høy utvinningsgrad og en høy oppløsning separasjon av et bredt område av molekylvekter ble oppnådd. Videre, de resulterende fraksjoner som er kompatible med de fleste nedstrøms biokjemiske og biofysiske proteinanalyser.
Protocol
Representative Results
Discussion
CN-GELFrEE er avledet fra den klare native (CN) PAGE buffersystem som bruker en blanding av anioniske og nøytrale detergenter som bærermolekyler 9 for molekylvekt basert på proteinfraksjonering gjennom en gelmatriks. Anvendelsen av CN-GELFrEE til en innfødt mus hjerte protein ekstrakt generert lav kompleksitet fraksjoner med diskrete båndbredder og samtidig opprettholde ikke-kovalente interaksjoner av biomolekylære forsamlinger. Sammenligning av brøker mellom CN-PAGE og reduserende SDS-PAGE slabgeler v…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
WM Keck Foundation sjenerøst gitt midler til dette arbeidet. Dette materialet er basert på arbeid støttet av FAPERJ forskningsstipend 100,039 / 2014 fra myndighetene i Rio de Janeiro – Brasil for RDM, Science Without Borders stipend 88888,075416 / 2013-00 fra Koordinerings for bedring av høyere utdanning personell, under regjeringen i Brasil, for HSS, National Science Foundation Graduate Research Fellowship etter fellesskap nummer 2014171659 for oSS, og ved CNPq forskningsstipend 202011 / 2012-7 fra myndighetene i Brasil for LHFDVPCH er en mottaker av en Northwestern University Kjemi til livsprosessene Institute Postdoktor Fellowship Award.
Materials
| Reagents | |||
| 30% acrylamide/bis solution, 37.5:1 | Bio-Rad | 161-0158 | This solution is neurotoxic. |
| 6-aminohexanoic acid (ε-aminocaproic acid) | Sigma-Aldrich | A2504 | This chemical is an irritant. |
| Ammonium persulfate (APS) | Fisher Scientific | 7727-54-0 | This chemical is flammable, toxic, and corrosive. |
| Coomassie blue G250 | Bio-Rad | 161-0406 | |
| Dodecylmaltoside | Sigma-Aldrich | D4641 | This chemical is an irritant. |
| Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | FLUKA | 3777 | This chemical is toxic. |
| Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP120 | This chemical is toxic. |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Liquid nitrogen | Any supplier | n/a | Store liquid nitrogen in containers designed for low-temperature liquids |
| Mouse heart | Bioreclamation LLC | MSE-HEART | |
| n-butanol | Fisher Scientific | 71-36-3 | This chemical is flammable and toxic. |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | BP103 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Fisher Scientific | 78430 | This chemical is toxic. |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | This chemical is an irritant. |
| Sucrose | JTBaker | 4097 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-Rad | 161-0800 | This chemical flammable and irritant. |
| Tris-HCl | Amresco | M151 | |
| Trycine | Bio-Rad | 161-071 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Gradient mixer | Hoefer | SG15 | |
| Magnetic stir | Any supplier | n/a | |
| Magnetic bars | Any supplier | n/a | Small enough to fit inside the gradiet mixer chambers. |
| Power supply | Bio-Rad | 164-5056 | Voltage up to 1,500 V |
| Refrigerated centrifugue | Eppendorf | 022622552 | Up to 15,000 x g |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 15 mL conical tube | Any supplier | n/a | |
| 30-kDa-MWCO ultra centrifugal filter | Millipore | UFC503096 | |
| Flexible tubing | Saint-Gobain | B000FOV1J0 | Approximately 1 m length |
| Ice bucket | Any supplier | n/a | |
| Liquid/air metallic or plastic valve. (e.g. aquarium air/water flow control lever valve) | Any supplier | n/a | Aquarium valves are compatible. |
| Mortar and pestle | Any supplier | n/a | |
| Native PAGE 3-12% T slab gel | Invitrogen | BN1003 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-13 | |
| Protein low bind tube 1.5 mL | Eppendorf | 022431081 | |
| Razor blade | IDL Tools | TE05-091C | |
| Regenerated cellulose dialysis tubing 3,500 MWCO | Fisher Scientific | 21-152-9 | |
| SDS-PAGE slab gel for any kDa | Bio-Rad | 456-9036 | |
| Serological pipets (25 ml) | VWR | 89130-900 | |
| Syringe (10 ml) | Any supplier | n/a | |
Riferimenti
- Alberts, B. The Cell as a Collection of Protein Machines: Preparing the Next Generation of Molecular Biologists. Cell. 92 (3), 291-294 (1998).
- Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. Analysis of protein complexes using mass spectrometry. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (8), 645-654 (2007).
- Gavin, A. C., Bösche, M., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).
- Puig, O., Caspary, F., et al. The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Cremer, K. D., Hulle, M. V., et al. Fractionation of vanadium complexes in serum, packed cells and tissues of Wistar rats by means of gel filtration and anion-exchange chromatography. JBIC J. Biol. Inorg. Chem. 7 (7-8), 884-890 (2002).
- Tanese, N. Small-Scale Density Gradient Sedimentation to Separate and Analyze Multiprotein Complexes. Methods. 12 (3), 224-234 (1997).
- Bunai, K., Yamane, K. Effectiveness and limitation of two-dimensional gel electrophoresis in bacterial membrane protein proteomics and perspectives. J. Chromatogr. B. 815 (1-2), 227-236 (2005).
- Wittig, I., Schägger, H. Advantages and limitations of clear-native PAGE. PROTEOMICS. 5 (17), 4338-4346 (2005).
- Skinner, O. S., Do Vale, L. H. F., et al. Native GELFrEE: A New Separation Technique for Biomolecular Assemblies. Anal. Chem. 87 (5), 3032-3038 (2015).
- Nijtmans, L. G. J., Henderson, N. S., Holt, I. J. Blue Native electrophoresis to study mitochondrial and other protein complexes. Methods. 26 (4), 327-334 (2002).
- Tran, J. C., Doucette, A. A. Gel-Eluted Liquid Fraction Entrapment Electrophoresis: An Electrophoretic Method for Broad Molecular Weight Range Proteome Separation. Anal. Chem. 80 (5), 1568-1573 (2008).
- Smith, P. K., Krohn, R. I., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
