CN-GELFrEE - Clear Native гель-элюированный жидкая фракция Entrapment электрофорез
Summary
This protocol describes how to prepare and perform clear native gel-eluted liquid fraction entrapment electrophoresis (CN-GELFrEE), a native separation technique for non-covalent biomolecular assemblies and proteins from heterogeneous samples that is compatible with various downstream protein analysis techniques.
Abstract
Белковые комплексы выполняют множество важных клеточных функций. Выяснение их нековалентных взаимодействий и динамики имеет первостепенное значение для понимания роли комплексов в биологических системах. В то время как прямая характеристика биомолекулярными узлов приобретает все большее значение в последние годы, отечественные методы фракционирования, которые совместимы с ниже по течению методов анализа, в том числе масс-спектрометрии, которые необходимы для дальнейшего расширения этих исследований. Тем не менее, поле не хватает высокой пропускной способности, широкий ассортимент, высокое восстановления метод разделения для нативного белка сборок. Здесь мы приводим четкую нативный гель-элюированный жидкая фракция экстрагирующее электрофорез (CN-GELFrEE), который является новым модальность разделения для нековалентных белковых агрегатов. эффективность разделения CN-GELFrEE была продемонстрирована ректификационных комплексов, извлеченных из сердца мыши. Фракции собирали в течение 2 ч и отображаются дискретные полосы в диапазоне от ~ 30 до 500 кДа. мошенникнаблюдалась последовательны модель увеличения ширины полосы молекулярного веса, каждый в пределах ~ 100 кДа. Кроме того, последующее переанализ родных фракций с помощью SDS-PAGE показал молекулярной массы сдвигает в соответствии с денатурации белковых комплексов. Поэтому, CN-GELFrEE было доказано, чтобы предложить возможность выполнять с высоким разрешением и высокой восстановления родные разделений на белковых комплексов из большого диапазона молекулярной массы, обеспечивая фракции, которые совместимы с белком анализа вниз по течению.
Introduction
Большинство биологических процессов , происходящих в клетке , как полагают, осуществляется с помощью белковых агрегатов , а не единичных белков 1. Следовательно, для того , чтобы выяснить специфическую биологическую роль субъединицы белка в клетке, необходимо понимать его структурные взаимодействия с другими белками или лигандов в комплексах 2. Тем не менее, изучение белков изначально, поддерживая их нековалентных взаимодействий и активность, остается сложной. Одним из недостатков нативных изучения белков является подходящим нативный метод разделения, который совместим с различными методами вниз по течению анализа белков. Поэтому в последнее время интерес к методам разделения , способные характеризовать нековалентных сборки биомолекул резко возросла 3.
методы разделения белков крайне важны для биохимии, биофизики и различных других исследований. Современные отечественные методы разделения имеют intrinsiC недостатки, которые снижают совместимость с ниже по течению анализов, таких как низкое разрешение, низкая пропускная способность, потери осадков, а также требование больших количеств исходного образца. Аффинной очистки Tandem обычно используется для исследования взаимодействия белка, но оно должно проводиться отдельно для каждого белка – мишени, в результате чего ее несовместимой с анализом высокой пропускной способностью 4. Хроматографи с исключением размеров 5, избирательное осаждение с ионом аффинной хроматографии 5 и градиенте плотности разделения 6 все предусмотрели нативные разделений, но по своей сути являются методы с низким разрешением и требуют высоких начальных количеств образцов.
В качестве альтернативы, гель на основе методики, такие как голубой Native (BN) и Clear Native (CN) PAGE (либо 1-D или 2-D), отображать разделение с высоким разрешением. Кроме того, контрастирующие с упомянуто другие методы, как родные СТР разделений поддерживают растворимость и нативную конформацию широкого гАнж макромолекулы видов, в том числе гидрофобных белков. Эта возможность дополнительно расширяет охват протеома достигнутый этими методами 7,8 и достигается за счет различной химии между CN и BN-PAGE. CN-PAGE обычно полагается на мягкие заряженные моющие средства в качестве молекул-носителей, заменяя Кумасси синего красителя в BN-PAGE. BN-PAGE, хотя связано с более высоким разрешением, имеет подводные камни , такие как снижение ферментативной активности в разделенных белков 8 и образованием молекулы Кумасси аддукта, причем последний значительно ущемляет вниз по течению масс – спектрального анализа 9. Оба эти методы, однако, традиционно ассоциируется с низким уровнем восстановления и узкого охвата протеома из – за окрашивания и ограничений экстракции геля 7.
Для изучения денатурированных белков, существует несколько методов, которые поддерживают растворимость макромолекулы при выполнении высокого разрешения фракционирования с регенерацией с высоким содержанием белка, и которые совместимы с Diverse методы анализа белков после разделения. Гель-элюированный жидкая фракция Защемление Электрофорез (GELFrEE) является одним из методов фракционирования, которые соответствуют всем этим характеристикам. Этот метод широко применяется в высоких пропускной исследованиях сверху вниз протеомики, указывая, что он быстр и универсален. В GELFrEE, белки денатурируют и отделены друг от друга на основе молекулярной массы через трубчатую гелевую матрицу, пористость которых может изменяться в зависимости от требований образца и от желаемых результатов фракционирования. Фракции элюировали в жидкой фазе, тем самым уменьшая ограничения восстановления, связанные с SDS-PAGE при сохранении высокого разрешения. Фракция аликвоты затем могут быть проанализированы с помощью 1-D PAGE для выбора полосы пропускания молекулярной массы 11. Существует высокий спрос на преимущества, связанные с GELFrEE в родных методами разделения. Описанный здесь метод Clear Родные GELFrEE (CN-GELFrEE), является уроженцем адаптация GELFrEE. Для того, чтобы быть совместимым с широкойяpectrum макромолекул в нативном состоянии, этот метод основан не только на мягкой химии CN-PAGE, но и на разделении пористости градиента, что уменьшает осаждение белков, устраняя резкий переход между пористостью , присутствующих в прерывистых гелевых системах 9. При применении к фракционирования белковых комплексов, выделенных из сердца мыши, элюированные фракции отображается высокое извлечение и разделение с высоким разрешением в широком диапазоне молекулярных масс был получен. Далее, полученные фракции совместимы с большинством вниз по течению биохимические и биофизические белковый анализ.
Protocol
Representative Results
Discussion
CN-GELFrEE происходит от родной ясно (CN) СТР буферной системы , которая использует смесь анионных и нейтральных моющих средств в качестве молекул – носителей 9 для молекулярной массы на основе фракционирования белков через матрицу геля. Применение CN-GELFrEE к родному экстракта белка мыши ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Кек фонд WM любезно предоставили финансирование для этой работы. Этот материал основан на работе, поддержанной исследовательского гранта FAPERJ 100,039 / 2014 от правительства Рио-де-Жанейро – Бразилия для RDM, науки без границ науки +88888,075416 / 2013-00 от координации по улучшению высшего образования персонала, при правительстве из Бразилии, HSS, Национальный научный фонд стипендий Магистратура исследований в рамках стипендий номером 2014171659 для ОСС, и исследовательский грант CNPq 202011 / 2012-7 от правительства Бразилии для LHFDVPCH является получателем химии северо-западного университета жизненных процессов института Постдокторское Присуждение стипендий.
Materials
| Reagents | |||
| 30% acrylamide/bis solution, 37.5:1 | Bio-Rad | 161-0158 | This solution is neurotoxic. |
| 6-aminohexanoic acid (ε-aminocaproic acid) | Sigma-Aldrich | A2504 | This chemical is an irritant. |
| Ammonium persulfate (APS) | Fisher Scientific | 7727-54-0 | This chemical is flammable, toxic, and corrosive. |
| Coomassie blue G250 | Bio-Rad | 161-0406 | |
| Dodecylmaltoside | Sigma-Aldrich | D4641 | This chemical is an irritant. |
| Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | FLUKA | 3777 | This chemical is toxic. |
| Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP120 | This chemical is toxic. |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Liquid nitrogen | Any supplier | n/a | Store liquid nitrogen in containers designed for low-temperature liquids |
| Mouse heart | Bioreclamation LLC | MSE-HEART | |
| n-butanol | Fisher Scientific | 71-36-3 | This chemical is flammable and toxic. |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | BP103 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Fisher Scientific | 78430 | This chemical is toxic. |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | This chemical is an irritant. |
| Sucrose | JTBaker | 4097 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-Rad | 161-0800 | This chemical flammable and irritant. |
| Tris-HCl | Amresco | M151 | |
| Trycine | Bio-Rad | 161-071 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Gradient mixer | Hoefer | SG15 | |
| Magnetic stir | Any supplier | n/a | |
| Magnetic bars | Any supplier | n/a | Small enough to fit inside the gradiet mixer chambers. |
| Power supply | Bio-Rad | 164-5056 | Voltage up to 1,500 V |
| Refrigerated centrifugue | Eppendorf | 022622552 | Up to 15,000 x g |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 15 mL conical tube | Any supplier | n/a | |
| 30-kDa-MWCO ultra centrifugal filter | Millipore | UFC503096 | |
| Flexible tubing | Saint-Gobain | B000FOV1J0 | Approximately 1 m length |
| Ice bucket | Any supplier | n/a | |
| Liquid/air metallic or plastic valve. (e.g. aquarium air/water flow control lever valve) | Any supplier | n/a | Aquarium valves are compatible. |
| Mortar and pestle | Any supplier | n/a | |
| Native PAGE 3-12% T slab gel | Invitrogen | BN1003 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-13 | |
| Protein low bind tube 1.5 mL | Eppendorf | 022431081 | |
| Razor blade | IDL Tools | TE05-091C | |
| Regenerated cellulose dialysis tubing 3,500 MWCO | Fisher Scientific | 21-152-9 | |
| SDS-PAGE slab gel for any kDa | Bio-Rad | 456-9036 | |
| Serological pipets (25 ml) | VWR | 89130-900 | |
| Syringe (10 ml) | Any supplier | n/a | |
Riferimenti
- Alberts, B. The Cell as a Collection of Protein Machines: Preparing the Next Generation of Molecular Biologists. Cell. 92 (3), 291-294 (1998).
- Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. Analysis of protein complexes using mass spectrometry. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (8), 645-654 (2007).
- Gavin, A. C., Bösche, M., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).
- Puig, O., Caspary, F., et al. The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Cremer, K. D., Hulle, M. V., et al. Fractionation of vanadium complexes in serum, packed cells and tissues of Wistar rats by means of gel filtration and anion-exchange chromatography. JBIC J. Biol. Inorg. Chem. 7 (7-8), 884-890 (2002).
- Tanese, N. Small-Scale Density Gradient Sedimentation to Separate and Analyze Multiprotein Complexes. Methods. 12 (3), 224-234 (1997).
- Bunai, K., Yamane, K. Effectiveness and limitation of two-dimensional gel electrophoresis in bacterial membrane protein proteomics and perspectives. J. Chromatogr. B. 815 (1-2), 227-236 (2005).
- Wittig, I., Schägger, H. Advantages and limitations of clear-native PAGE. PROTEOMICS. 5 (17), 4338-4346 (2005).
- Skinner, O. S., Do Vale, L. H. F., et al. Native GELFrEE: A New Separation Technique for Biomolecular Assemblies. Anal. Chem. 87 (5), 3032-3038 (2015).
- Nijtmans, L. G. J., Henderson, N. S., Holt, I. J. Blue Native electrophoresis to study mitochondrial and other protein complexes. Methods. 26 (4), 327-334 (2002).
- Tran, J. C., Doucette, A. A. Gel-Eluted Liquid Fraction Entrapment Electrophoresis: An Electrophoretic Method for Broad Molecular Weight Range Proteome Separation. Anal. Chem. 80 (5), 1568-1573 (2008).
- Smith, P. K., Krohn, R. I., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
