CN-gelfri - Clear Native Gel-eluerade vätskefraktion Entrapment Elektrofores
Summary
This protocol describes how to prepare and perform clear native gel-eluted liquid fraction entrapment electrophoresis (CN-GELFrEE), a native separation technique for non-covalent biomolecular assemblies and proteins from heterogeneous samples that is compatible with various downstream protein analysis techniques.
Abstract
Proteinkomplex utför en rad viktiga cellulära funktioner. Belysa deras icke-kovalenta interaktioner och dynamiken är avgörande för att förstå betydelsen av komplex i biologiska system. Medan den direkta karakterisering av biomolekylära församlingar har blivit allt viktigare under de senaste åren, inhemska fraktioneringstekniker som är kompatibla med efterföljande analystekniker, inklusive masspektrometri, är nödvändiga för att ytterligare utöka dessa studier. Icke desto mindre, i fältet saknar en hög genomströmning, wide-range, high-återhämtning separationsmetod för infödda proteinaggregat. Här presenterar vi klart nativ gel-eluerade vätskefraktion entrapment elektrofores (CN-gelfri), som är en ny separations modaliteten för icke-kovalenta proteinaggregat. CN-gelfri separationsprestanda visades genom fraktionering komplex som extraherats från mus hjärta. Fraktioner uppsamlades över två timmar och visas diskreta band som sträcker sig från ~ 30 till 500 kDa. En conkonsekvent mönster av ökande molekylvikt bandbredder observerades, var och en sträcker sig ~ 100 kDa. Vidare efterföljande återanalys av nativa fraktioner genom SDS-PAGE visade molekylvikt skiftar i överensstämmelse med den denaturering av proteinkomplex. Därför var CN-gelfri visat sig erbjuda möjligheten att utföra högupplösta och hög återhämtning nativa separationer på proteinkomplex från ett stort molekylviktsområde, som ger fraktioner som är kompatibla med efterföljande proteinanalyser.
Introduction
Majoriteten av biologiska processer som sker inuti en cell tros utföras av proteinaggregat i stället för enstaka proteiner 1. Följaktligen är det för att belysa den specifika biologiska rollen av ett protein-subenhet i en cell som krävs för att förstå de strukturella interaktioner med andra proteiner eller ligander i komplex 2. Men studera proteiner inbyggt, behålla sina icke-kovalenta interaktioner och aktivitet, förblir utmanande. En av bristerna av nativa proteinstudier är ett lämpligt nativ separationsteknik som är kompatibel med olika nedströms proteinanalystekniker. Därför har nyligen intresse i separationstekniker kan karakterisera icke-kovalenta aggregat av biomolekyler ökat kraftigt 3.
Proteinseparationstekniker är absolut nödvändigt att biokemi, biofysik och olika andra studier. Aktuella nativa separationstekniker har intrinsic brister som minskar kompatibilitet med efterföljande analyser, såsom låg upplösning, låg genomströmning, förlust för nederbörd, och kravet på stora mängder ursprungliga provet. Tandem affinitetsrening används ofta för proteininteraktionsstudier, men det måste göras separat för varje protein mål, vilket gör att vara oförenlig med hög genomströmning analys 4. Gelkromatografi 5, selektiv utfällning med ion affinitetskromatografi 5 och densitets gradient separation 6 alla har gett inhemska separationer, men är i sig lågupplösta tekniker och kräver höga initiala provmängder.
Alternativt gelbaserade tekniker, såsom Blue Native (BN) och Clear Native (CN) PAGE (antingen 1-D eller 2-D), uppvisar hög upplösning separation. Dessutom kontrasterar med andra tekniker som nämns, både naturlig PAGE separationer upprätthålla löslighet och nativa konforma av ett brett range av makromolekyl arter, däribland hydrofoba proteiner. Denna förmåga breddar ytterligare proteomet täckning nås av dessa metoder 7,8 och uppnås genom olika kemi mellan CN och BN-PAGE. CN-PAGE förlitar vanligen på mjuk laddade rengöringsmedel som bärarmolekyler, ersätter Coomassie Blue färgämne i BN-PAGE. BN-PAGE, men i samband med högre upplösning, har förbehåll såsom minskad enzymatisk aktivitet i de separerade proteinerna 8 och Coomassie molekyl adduktbildning, den sistnämnda är mycket skadligt för nedströms MS analyser 9. Båda dessa metoder är emellertid traditionellt förknippas med låg återhämtning och smal proteom täckning tack vare färgning och gel utvinning begränsningar 7.
För studier av denaturerade proteiner, finns det flera tekniker som upprätthåller makromolekyl löslighet när de utför hög upplösning fraktionering med hög proteinutvinning och som är kompatibla med diverse post-separationsproteinanalystekniker. Gel-Eluerat vätskefraktionen Entrapment Elektrofores (gelfri) är en av de fraktioneringstekniker som passar alla dessa egenskaper. Denna metod är till stor del tillämpas i hög genomströmning top-down proteomikstudier, vilket indikerar att den är snabb och mångsidig. I gelfri proteiner denatureras och separeras baserat på molekylvikt genom en rörformad gelmatris kan porositet som varieras baserat på provkrav och de önskade fraktione resultat. Fraktioner elueras i vätskefas, vilket minskar återställnings begränsningar förknippade med SDS-PAGE med bibehållen hög upplösning. Bråk portioner kan sedan analyseras med en-D PAGE för molekylvikt val bandbredd 11. Det finns stor efterfrågan på de fördelar som är förknippade med gelfri i inhemska separationstekniker. Den metod som beskrivs häri, Clear Native gelfri (CN-gelfri), är en infödd anpassning av gelfri. För att vara kompatibel med en bred spectrum av makromolekyler i deras nativa tillstånd, förlitar sig denna metod inte bara på den mjuka CN-PAGE kemi, utan också på en porositet gradientseparation, vilket minskar proteinutfällning genom att eliminera den hårda övergången mellan porositeter som föreligger i diskontinuerliga gelsystem 9. När det appliceras på fraktionera proteinkomplex som extraherats från mushjärta, eluerade fraktionerna visas högt utbyte och en hög upplösning separation av ett brett intervall av molekylvikter erhölls. Vidare är de resulterande fraktionerna är kompatibla med de flesta nedströms biokemiska och biofysiska proteinanalyser.
Protocol
Representative Results
Discussion
CN-gelfri är härledd från den klara nativa (CN) PAGE-buffertsystemet som använder en blandning av anjoniska och neutrala detergenter som bärarmolekyler 9 för molekyl-viktbaserad proteinfraktionering genom en gelmatris. Tillämpningen av CN-gelfri till en infödd mus hjärta proteinextrakt genererade låga fraktioner komplexitet med diskreta bandbredder bibehållen icke-kovalenta interaktioner av biomolekylära församlingar. Jämförelse av fraktionerna mellan CN-PAGE och reducerande SDS-PAGE-skivgeler …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
WM Keck Foundation generöst finansierat detta arbete. Detta material är baserat på arbete som stöds av FAPERJ forskningsanslag 100,039 / 2014 från regeringen i Rio de Janeiro – Brasilien för RDM, vetenskap utan gränser stipendium 88888,075416 / 2013-00 från samordning för förbättring av högre utbildning personal, enligt regeringen Brasilien, för HSS, National Science Foundation Graduate Research Fellowship i gemenskap nummer 2014171659 för OSS, och CNPq forskningsanslag 202.011 / 2012-7 från regeringen i Brasilien för LHFDVPCH är en mottagare av en Northwestern University kemi livsprocesser Institute Forskar Fellowship Award.
Materials
| Reagents | |||
| 30% acrylamide/bis solution, 37.5:1 | Bio-Rad | 161-0158 | This solution is neurotoxic. |
| 6-aminohexanoic acid (ε-aminocaproic acid) | Sigma-Aldrich | A2504 | This chemical is an irritant. |
| Ammonium persulfate (APS) | Fisher Scientific | 7727-54-0 | This chemical is flammable, toxic, and corrosive. |
| Coomassie blue G250 | Bio-Rad | 161-0406 | |
| Dodecylmaltoside | Sigma-Aldrich | D4641 | This chemical is an irritant. |
| Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | FLUKA | 3777 | This chemical is toxic. |
| Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP120 | This chemical is toxic. |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Liquid nitrogen | Any supplier | n/a | Store liquid nitrogen in containers designed for low-temperature liquids |
| Mouse heart | Bioreclamation LLC | MSE-HEART | |
| n-butanol | Fisher Scientific | 71-36-3 | This chemical is flammable and toxic. |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | BP103 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Fisher Scientific | 78430 | This chemical is toxic. |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | This chemical is an irritant. |
| Sucrose | JTBaker | 4097 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-Rad | 161-0800 | This chemical flammable and irritant. |
| Tris-HCl | Amresco | M151 | |
| Trycine | Bio-Rad | 161-071 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Gradient mixer | Hoefer | SG15 | |
| Magnetic stir | Any supplier | n/a | |
| Magnetic bars | Any supplier | n/a | Small enough to fit inside the gradiet mixer chambers. |
| Power supply | Bio-Rad | 164-5056 | Voltage up to 1,500 V |
| Refrigerated centrifugue | Eppendorf | 022622552 | Up to 15,000 x g |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 15 mL conical tube | Any supplier | n/a | |
| 30-kDa-MWCO ultra centrifugal filter | Millipore | UFC503096 | |
| Flexible tubing | Saint-Gobain | B000FOV1J0 | Approximately 1 m length |
| Ice bucket | Any supplier | n/a | |
| Liquid/air metallic or plastic valve. (e.g. aquarium air/water flow control lever valve) | Any supplier | n/a | Aquarium valves are compatible. |
| Mortar and pestle | Any supplier | n/a | |
| Native PAGE 3-12% T slab gel | Invitrogen | BN1003 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-13 | |
| Protein low bind tube 1.5 mL | Eppendorf | 022431081 | |
| Razor blade | IDL Tools | TE05-091C | |
| Regenerated cellulose dialysis tubing 3,500 MWCO | Fisher Scientific | 21-152-9 | |
| SDS-PAGE slab gel for any kDa | Bio-Rad | 456-9036 | |
| Serological pipets (25 ml) | VWR | 89130-900 | |
| Syringe (10 ml) | Any supplier | n/a | |
Riferimenti
- Alberts, B. The Cell as a Collection of Protein Machines: Preparing the Next Generation of Molecular Biologists. Cell. 92 (3), 291-294 (1998).
- Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. Analysis of protein complexes using mass spectrometry. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (8), 645-654 (2007).
- Gavin, A. C., Bösche, M., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).
- Puig, O., Caspary, F., et al. The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Cremer, K. D., Hulle, M. V., et al. Fractionation of vanadium complexes in serum, packed cells and tissues of Wistar rats by means of gel filtration and anion-exchange chromatography. JBIC J. Biol. Inorg. Chem. 7 (7-8), 884-890 (2002).
- Tanese, N. Small-Scale Density Gradient Sedimentation to Separate and Analyze Multiprotein Complexes. Methods. 12 (3), 224-234 (1997).
- Bunai, K., Yamane, K. Effectiveness and limitation of two-dimensional gel electrophoresis in bacterial membrane protein proteomics and perspectives. J. Chromatogr. B. 815 (1-2), 227-236 (2005).
- Wittig, I., Schägger, H. Advantages and limitations of clear-native PAGE. PROTEOMICS. 5 (17), 4338-4346 (2005).
- Skinner, O. S., Do Vale, L. H. F., et al. Native GELFrEE: A New Separation Technique for Biomolecular Assemblies. Anal. Chem. 87 (5), 3032-3038 (2015).
- Nijtmans, L. G. J., Henderson, N. S., Holt, I. J. Blue Native electrophoresis to study mitochondrial and other protein complexes. Methods. 26 (4), 327-334 (2002).
- Tran, J. C., Doucette, A. A. Gel-Eluted Liquid Fraction Entrapment Electrophoresis: An Electrophoretic Method for Broad Molecular Weight Range Proteome Separation. Anal. Chem. 80 (5), 1568-1573 (2008).
- Smith, P. K., Krohn, R. I., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
