Monitoraggio celle in Zebrafish GFP-transgenico Utilizzo del sistema fotoconvertibile PSmOrange

Carlo A. Beretta; Nicolas Dross; Ulrike Engel; Matthias Carl

doi:10.3791/53604

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Articolo metodologico

Monitoraggio celle in Zebrafish GFP-transgenico Utilizzo del sistema fotoconvertibile PSmOrange

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DOI:

10.3791/53604

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5 febbraio 2016

Carlo A. Beretta¹^,²^,³ , Nicolas Dross² , Ulrike Engel² , Matthias Carl¹

¹Medical Faculty Mannheim, Department of Cell and Molecular Biology, Heidelberg University, ²COS and Nikon Imaging Center at the University of Heidelberg, Heidelberg University, ³Excellenzcluster CellNetworks, University of Heidelberg

In questo articolo

Sommario

Abbiamo stabilito il sistema fotoconvertibile PSmOrange come uno strumento potente, diretto e poco costoso per il tracciamento cellulare in vivo in sfondi transgenici GFP. Questo protocollo descrive la sua applicazione nel sistema modello di zebrafish.

Abstract

Il rapido sviluppo di embrioni trasparenti di pesce zebra (Danio rerio) in combinazione con l'etichettatura fluorescente di cellule e tessuti permette di visualizzare i processi di sviluppo mentre avvengono nell'animale vivente. Le cellule di interesse possono essere marcate utilizzando un promotore tessuto-specifico per guidare l'espressione di una proteina fluorescente (FP) per la generazione di linee transgeniche. L'utilizzo di proteine fotoconvertibili fluorescenti per questo scopo consente inoltre di seguire con precisione strutture definite all'interno del dominio di espressione. Illuminando la proteina nella regione di interesse, cambia il suo spettro di emissione ed evidenzia una particolare cellula o ammasso cellulare lasciando altre cellule transgeniche nel loro colore originale. Una delle principali limitazioni è la mancanza di promotori noti per un gran numero di tessuti nel pesce zebra. Al contrario, gli screening di trappole geniche e enhancer hanno generato enormi risorse transgeniche etichettando discretamente letteralmente tutte le strutture embrionali per lo più con GFP o, in misura minore, FP rosse o gialle. Un approccio per seguire strutture definite in tali background transgenici sarebbe quello di introdurre anche una proteina fotoconvertibile ubiquitaria, che potrebbe essere convertita nella cellula o nelle cellule di interesse. Tuttavia, le proteine fotoconvertibili disponibili comportano uno stato di emissione verde e/o meno frequentemente uno stato di emissione^{rosso 1} e quindi spesso non possono essere utilizzate per tracciare le cellule nel fondo FP delle linee transgeniche esistenti. Per aggirare questo problema, abbiamo istituito il sistema PSmOrange per il pesce zebra^2,3. Una semplice microiniezione di mRNA sintetico che codifica una forma nucleare di questa proteina marca tutti i nuclei cellulari con fluorescenza arancione/rossa. Dopo la fotoconversione mirata della proteina, cambia il suo spettro di emissione in rosso lontano. L'efficienza quantistica e la stabilità della proteina rendono PSmOrange un eccellente strumento di tracciamento cellulare per il pesce zebra e possibilmente per altre specie di teleostei.

Introduzione

Le tecniche di imaging che migliorano esponenzialmente consentono di seguire i processi di sviluppo per periodi di tempo fino a circa quattro giorni consecutivi³. Nel pesce zebra e in molti altri sistemi modello animale, cellule specifiche, tessuti, strutture assonali o vascolari sono contrassegnati da proteine fluorescenti transgeniche verdi o talvolta rosse o gialle per facilitare la visualizzazione. Tuttavia, nella maggior parte delle linee transgeniche il transgene non è espresso in modo specifico nelle cellule di interesse, ma anche in strutture aggiuntive, il che ostacola il tracciamento preciso, ad esempio, di singole cellule o gruppi di cellule.

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