Summary
التصوير تلألؤ بيولوجي هو أداة معروفة لتوطين الأورام والانبثاث، ولكن القياس الكمي لهذه الصور وغالبا ما يتطلب عمليات حسابية معقدة وأدوات معينة. نحن تصف طريقة luminoscore سهلة الاستخدام، على أساس شروط اكتساب دقيقة، لا تتطلب حسابات، وتمكين عبء الورم والاستجابة للعلاج التي يتعين رصدها في نماذج الفئران.
Introduction
يبقى الكشف المبكر عن الخلايا السرطانية تحديا وأمر حاسم لتعزيز فعالية علاج السرطان. في الجسم الحي تلألؤ بيولوجي التصوير (BLI) هي حساسة للغاية، تقنية البصرية موسع، وتستخدم على نطاق واسع لرصد الأورام في الحيوانات الصغيرة. تستخدم اليراع الخلايا، معربا عن وسيفيراز عادة لمثل هذه التجارب 1،2. هذا أوكسيجيناز يكسد-D وسيفيرين مع الأكسجين الجزيئي ولكن يتطلب اثنين من العوامل المساعدة - المغنيسيوم 2+ وأدينوسين ثلاثي الفوسفات 3. اليراع وسيفيراز هو أكثر ملاءمة للتصوير في الجسم الحي من renilla وسيفيراز 4 لأن الغلة الكم أعلى.
الركيزة أكسدة - oxyluciferin - تنبعث من تلقاء أنفسهم فوتون للعودة إلى الدولة الأساسية ومن ثم تصبح غير نشطة. الفوتونات المنبعثة يكون الحد الأقصى لطول موجة حوالي 530 نانومتر. ويمكن للكاميرا عالية الحساسية للكشف عن الفوتونات الانارة من الداخل من الحيوانات الصغيرة، وتوفير الصور التي تجعل من POSSible لتحديد موقع الخلايا السرطانية.
القدرة على تحديد عبء الورم بدقة التهم الفوتون يمكن أن يكون بمثابة أداة قوية وحساسة لقياس فعالية العلاج. لأن آثار العلاج يمكن أن يتم الكشف عاجلا، هذه الحساسية قد تجعل من الممكن تحديد اللحظة الدقيقة التي تصبح فيها العلاج الفعال.
الكمي المطلق من إجمالي الفوتونات المنبعثة معقد جدا. يعتمد عدد الفوتونات التي تم جمعها على عمق الورم وعلى الأعضاء وتنبعث الفوتونات من خلال. ويمكن حساب معامل التصحيح بناء على معاملات امتصاص الأنسجة 5، ولكن الكمي المطلق من أعداد الخلايا السرطانية يتطلب معرفة عدد الفوتونات المنبعثة من كل الخلايا السرطانية. وعلاوة على ذلك، التعبير وسيفيراز، مثلها في ذلك مثل العديد من الجينات مراسل (على سبيل المثال، البروتينات الفلورية) ليست متجانسة، حتى في السكان الخلية المستمدة من استنساخ واحد (6). عدد إبليسلا يمكن أن تحسب البروتينات بورصة عمان في الخلايا بالضبط. تهيئة الظروف التجريبية الموحدة وهكذا يبدو حاسما لتحليل موثوق نصف الكمية.
طبقنا طريقة luminoscore لاثنين من نماذج مختلفة اللمفاوية للفئران 7،8،9. في هذه النماذج، يتم حقن الخلايا السرطانية مسانج في العين أو تحت الجلد للحصول على التوالي، وسرطان الغدد الليمفاوية العين (PIOL) النموذج الأولي وسرطان الغدد الليمفاوية تحت الجلد (SCL) نموذج. في كل من هذه النماذج مثلي، يدار العلاج في الوضع الطبيعي، بعد سبعة أيام من التلقيح الورم لPIOL وعندما وصلت الورم 0،5-0،7 سم في أكبر قطرها عن SCL.
استخدمنا طريقة luminoscore لرصد آثار الموقع العلاج الدليل السياسي الشامل، والتي تظهر سابقا أن تكون فعالة 7،10،11. الدليل السياسي الشامل هو تسلسل قليل النوكليوتيد ويجند من TLR9، والذي بدوره هو مستقبلات الخلايا التي عبرت عنها العديد مLLS الجهاز المناعي، بما في ذلك الخلايا الجذعية، الخلايا الليمفاوية B، وحيدات، والخلايا القاتلة الطبيعية. الدليل السياسي الشامل الحمض النووي هو 20 مير تسلسل الحمض النووي الذي يحتوي على الدليل السياسي الشامل (CG) عزر يمونوستيمولاتوري. المراقبة (ODN السيطرة) هو نفسه 20 مير تسلسل الحمض النووي، إلا أن تسلسل CG يمونوستيمولاتوري هو مقلوب (GC). مشاركة TLR9 في الغدد الليمفاوية الفئران نحن ندرس يستحث موت الخلايا المبرمج 10، ينشط الجهاز المناعي 12، وبالتالي يخفف كثيرا من عبء الورم 7،11.
نحن هنا وصف طريقة معيارية لقياس عبء الورم والاستجابة للعلاج من خلال الصور إضاءة الحيوية. ويعتمد هذا الأسلوب على جوانب مختلفة من إجراء التصوير، من الاستحواذ على التحليل، لتحسين الموثوقية، استنساخ، والاعتماد غير مستخدم، ودلالة إحصائية. ويعزى مؤشر تلألؤ بيولوجي الكمي إلى كل فأر. ، ويمكن مقارنة هذه القيمة، الذي نسميه luminoscore ليس فقط بين الحيوانات ولكن اللهحتى بين التجارب.
في هذا العمل، ونحن نركز على إجراء التصوير تلألؤ بيولوجي فضلا عن تقدير صورة من طريقة luminoscore. نقدم لك مجموعة من فعالية هذه الطريقة للتحقق من الحقن، ورصد عبء الورم، وتقييم فعالية علاج السرطان الموقع في. ويتضح من كل هذه النقاط في نتائج ممثلة من التجارب باستخدام نماذج الماوس المختلفة لتسليط الضوء على التكيف من طريقة luminoscore.
Protocol
جميع الإجراءات التي تنطوي على الفئران ينسجم مع المبادئ التوجيهية للاتحاد الأوروبي واللوائح الفرنسية لإجراء التجارب على الحيوانات (وزارة الزراعة القانون رقم 2001-464، مايو 2001)، والمبادئ التوجيهية للمجلس الوطنى لدي لا سانتيه آخرون دي لا جنة (INSERM) ميديكال بحوث المعهد على بحوث الحيوان، وتمت الموافقة من قبل اللجنة المحلية ذات الصلة (لجنة الأخلاقيات داروين تشارلز لتجارب على الحيوانات، باريس، فرنسا؛ عدد تصريح: P3 / 2009/004).
1. خلية التحضير
- تنمو الماوس B خط الخلية سرطان الغدد الليمفاوية A20.IIA-luc2 في RPMI-1640 Glutamax المتوسطة تستكمل مع 10٪ مصل العجل الجنين، و 100 ميكروغرام / مل البنسلين، 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين، 10 ملي البيروفات الصوديوم، 50 ميكرومتر 2-المركابتويثانول، و0.50 ملغ / مل هيغروميسين B.
- الحفاظ على زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 وتغيير المتوسطة كل 2-3 أيام. حصاد 5 مل من تعليق الخلية مع ماصة يوم واحد بعد تغيير المتوسطة.
- خلايا تدور في 3005؛ ز لمدة 10 دقيقة وتعليق الخلايا في 3 مل العقيمة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). كرر هذه الخطوة مرتين لغسل الخلايا.
- مزيج 15 ميكرولتر من تعليق خلية مع 30 ميكرولتر التريبان الأزرق وسم قبل تحميل غرفة عد مالاسيه. حساب تركيز الخلية التي تحتوي على الصيغة: التركيز (خلية / مل) = عدد الخلايا في شبكة العد * 3 * 1000.
- تدور خلية واحدة لمزيد من الوقت في 300 x ج لمدة 10 دقيقة. إزالة طاف مع ماصة. مع C تركيز محسوبة على خطوة 1.4)، وعدد من الخلايا N = C * 3.
- حساب حجم برنامج تلفزيوني العقيمة 1X المطلوبة للحصول على تعليق خلية وبتركيز 5 × 10 7 خلية / مل مع الصيغة التالية: برنامج تلفزيوني الحجم (مل) = N / (5 × 10 7). تعليق بيليه خلية (من الخطوة 1.5)) في حجم برنامج تلفزيوني العقيمة 1X المحسوبة في الجملة السابقة. تعليق خلية (أ) هو لاستخدامها في نموذج SCL (في الجسم الحي حجم حقن 100 ميكرولتر: 5 × 10 6 خليةق).
- ماصة 10 ميكرولتر من تعليق خلية ألف وإضافة 90 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني العقيمة في أنبوب 1.5 مل للحصول على 100 ميكرولتر من تعليق خلية B في 5 × 10 6 خلايا لكل مل. تعليق الخلايا البائية لاستخدامه في نموذج PIOL (في الجسم الحي حجم حقن هو 2 ميكرولتر: 1 × 10 4 خلايا).
2. وسيفيرين
- تمييع 1 غرام من مسحوق ملح البوتاسيوم-D وسيفيرين في 30 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة 1X في أنبوب 50 مل ويهز لبضع ثوان لإذابة الحصى.
ملاحظة: لأن وسيفيرين غير حساسة للضوء، وإعداد 500 مكل في الظلام أنابيب microcentrifuge 1.5 مل. - تخزين aliquots في -20 درجة مئوية.
ملاحظة: يمكن تخزين قسامات لعدة أشهر.
بعد ذوبان الجليد، ويجب ألا يتم تخزين قسامات لأكثر من 1 يوم في + 4 ° C. دورات تجميد لاذابة هي الأفضل لتخزين عند 4 درجات مئوية. - ضخ 100 ميكرولتر من مد وسيفيرين حل ملح البوتاسيوم البريتونى لكل آسا التصويرذ.
ملاحظة: هذا الحل يتوافق مع 3.3 ملغ لكل فأر لجرعة 150 ملغ / كغ.
3. خليط التخدير والتخدير
- يعد حل مخدر عن طريق خلط الكيتامين 120 ملغ / كغ وزيلازين 6 ملغ / كغ في برنامج تلفزيوني العقيمة 1X.
- ضخ 60 ميكرولتر من مزيج مخدر داخل الصفاق لكل فحص التصوير مع إبرة 25 G. لعملية جراحية (مع PIOL أو نموذج SCL)، وضخ 80 ميكرولتر من الخليط للحصول على التخدير أعمق. وضع الماوس مرة أخرى في قفصه.
- عندما يظهر الماوس متحرك، إزالته من قفصه والضغط بلطف الساق الماوس، بين الأصابع. إذا يتفاعل الماوس مع رد الفعل الهروب، انتظر عدة دقائق. كرر الإجراء حتى لا يتفاعل الماوس، مما يؤكد التخدير مرضية.
- ضع الماوس على لوحة ظاهرة الاحتباس أو تحت ضوء ارتفاع درجات الحرارة.
- تطبيق مرهم العين لتجنب جفاف العين أثناء التخدير لفحص التصوير أو لعملية جراحية SCL. تطبيقمرهم العين بعد عملية جراحية لنموذج PIOL.
4. الجراحة وتلقيح الخلية
ملاحظة: إجراء جميع العمليات الجراحية على لوحة ظاهرة الاحتباس أو تحت ضوء ارتفاع درجات الحرارة، في نوع خزانة السلامة 1 الميكروبيولوجية في منشأة مستوى السلامة الحيوية الحيوانية 2. تم تعقيمها جميع الأدوات الجراحية المستخدمة في هذا القسم قبل الاستخدام.
- تحت الجلد الغدد اللمفاوية نموذج:
- إعداد 100 ميكرولتر من تعليق الخلية التي تم الحصول عليها في الخطوة 1.6 في حقنة 1 مل مع إبرة 25 G. الضغط بلطف الجلد الماوس على الجهة بين الأصابع، في موقع الحقن. ادخال الإبرة بالضبط في طية الجلد. لضمان حقن تحت الجلد، لا تضع إبرة في عمق الأنسجة.
- حقن الخلايا في طبقات الجلد. مراقبة ما اذا كانت الكرة السائلة قليلا يظهر تحت الجلد للتأكد من أن حقن أنجز بشكل صحيح.
- إعداد 100 ميكرولتر من تعليق الخلية التي تم الحصول عليها في الخطوة 1.6 في حقنة 1 مل مع إبرة 25 G. الضغط بلطف الجلد الماوس على الجهة بين الأصابع، في موقع الحقن. ادخال الإبرة بالضبط في طية الجلد. لضمان حقن تحت الجلد، لا تضع إبرة في عمق الأنسجة.
- PIOL نموذج:
ملاحظة: هذه صناعة تجDURE يتطلب 2 المشغلين، والمشار إليها هنا كمشغل 1 و 2 المشغل.- إزالة الملتحمة:
- هل لديك مشغل 1 مكان الماوس تشريح تحت المجهر. اضغط بلطف مع أصابع في كل جانب من العين لمسحها. الحفاظ على هذا الموقف.
- هل لديك مشغل 2 لتر اوك من خلال المجهر تشريح. قبضة الملتحمة مع زوج صغير من كماشة في يد واحدة. مع جهة أخرى، وقطع الملتحمة فقط تحت كماشة مع زوج من مقص صغير الجراحية.
- هل لديك مشغل 1 الإفراج عين الماوس ضغط في خطوة 4.2.1.1)
- حقن الخلايا:
- إعداد 10 ميكرولتر حادة الدقة حقنة. غسله بواسطة ضخ الماء منزوع الأيونات معقمة من خلال ذلك. كرر مرتين أو ثلاث مرات للتأكد من عدم وجود فقاعات في المحقنة. ثم إعداد 2 ميكرولتر من تعليق خلية للحقن.
- هل لديك مشغل 2 الصحافة بلطف مع أصابع علىالبريد يد في كل جانب من العين لمسحها. الحفاظ على هذا الموقف.
- هل لديك مشغل 1 قبضة حافة العين مع زوج صغير من كماشة في يد واحدة وتسحبه بلطف الى الوراء على امتداد النسيج.
- هل لديك مشغل 2 لتر اوك من خلال المجهر تشريح. مع جهة أخرى، وجعل ثقب صغير في مقلة العين أدنى من الفأرة مع إبرة 32 G.
- هل لديك مشغل 2 اخماد الإبرة والتقاط (مع نفس اليد) حقنة الدقة وادخال الإبرة في ثقب المحرز في خطوة 4.2.2.4.
- هل لديك مشغل 1 ضغط على المكبس حقنة مع جهة أخرى.
- هل لديك مشغل 2 ضد erify مع المجهر تشريح أن تعليق خلية في حقنة تم حقنها بشكل صحيح داخل مقلة العين (تدفق السائل يمكن ملاحظتها بسهولة).
- هل لديك مشغل 2 ص emove حقنة الدقة.
- هل لديك مشغل 1 ص ELEASE حافة ليجتاح آي مال العين في خطوة 4.2.2.3)
- هل لديك مشغل 2 ص ELEASE جانبي العين ضغطت على خطوة 4.2.2.2)
- تطبيق مرهم العين على الفور.
ملاحظة: إذا تم تنفيذ جميع الخطوات بشكل صحيح، يجب أن الماوس لا تنزف على الإطلاق خلال هذا الإجراء.
- إزالة الملتحمة:
التصوير 5. ضوء بارد - يوم 0
ملاحظة: جميع المنتجات حقنها في الماوس يجب أن تكون على RT قبل الحقن. بعد الورم تم تلقيح خلايا، وبينما لا يزال تخدير الحيوان، انتقل إلى هذه الخطوات للتصوير.
- بدوره على تصوير وفتح البرنامج الاستحواذ. تهيئة الكاميرا، ومراحل، والعدسات عن طريق النقر على زر "تهيئة". سوف التهيئة تأخذ من 10 إلى 15 دقيقة ليكتمل.
- ضخ 100 ميكرولتر من مد وسيفيرين حل ملح البوتاسيوم البريتونى مع إبرة 25 G. لا إدارته عن طريق الوريد. إذا intravenouمطلوب إدارة الصورة لأي سبب من الأسباب، وملح الصوديوم-D وسيفيرين يجب أن تستخدم بدلا من ملح البوتاسيوم D-وسيفيرين.
ملاحظة: وسيفيرين غير المتفاعلة الزائدة في هذا التركيز. وبالتالي فإن إشارة تلألؤ بيولوجي تصل إلى القاع بعد 3-7 دقائق واستمرت لأكثر من 30 دقيقة. - 10 دقيقة بعد مد وسيفيرين حقن 13، ضع الماوس الموضوع في تصوير. ضع الماوس في موقعها الطبيعي، ظهرها نحو الكاميرا، في منصب شقة ممكن. هذا موقف طبيعي واستنساخه بسهولة.
- وضع علامة ميزة لصناعة السيارات في التعرض، وانقر على اكتساب للحصول على الصورة مرة أخرى (الخلفي) للحيوان، مع ميزة لصناعة السيارات في التعرض.
ملاحظة: ميزة لصناعة السيارات في التعرض يحسن وقت التعرض عن طريق حساب عليه من صورة التعرض 1 ثانية. إذا إشارة تلألؤ بيولوجي الماوس، سلبية أو منخفضة جدا، قد تكون هذه هي المرة التعرض الأمثلمجموعة تلقائيا إلى أكثر من 20 دقيقة. في هذه الحالة، ومدة التعرض من 8 إلى 10 دقيقة قد تكون حلا وسطا جيدا. قد يتم تعيين وقت التعرض يدويا، ولكن الصور يجب أن لا يحتوي بكسل المشبعة. - تحويل الماوس فوق لفضح أمام الماوس إلى الكاميرا. محاولة لشد الماوس ونشر أطرافه الأمامية بحيث لا تحجب الصدر.
- الحصول على صورة الأمامية للحيوان. تحقق من أن السيارات مربع التعرض لا يزال تكتك وانقر مرة أخرى على زر "اكتساب".
ملاحظة: يمكن الحصول على صورة الأمامية قبل الصورة الخلفية والعكس بالعكس. الوقت تعرض الأمامي والخلفي الصور يمكن أن تكون مختلفة اعتمادا على الكثافة النسبية من كل جانب من الفأرة. ويحسب تلقائيا عند استخدام ميزة لصناعة السيارات في التعرض. يستخدم الكمي فقط تدفق الفوتون (الفوتونات في الثانية) ولا يعتمد على مدة التعرض. - ضع الماوس على بلات الاحتباس الحراريالبريد أو تحت ضوء ارتفاع درجات الحرارة حتى يتعافى من مخدر ثم ضعه مرة أخرى في قفصه.
التصوير 6. ضوء بارد - بعد يوم 0
- بدوره على تصوير، تهيئة الكاميرا، ومراحل، والعدسات كما في الخطوة 5.1).
- تخدير الفأر مع حقنة داخل الصفاق من 60 ميكرولتر من خليط الكيتامين (120 ملغ / كلغ) / زيلازين (6 ملغ / كغ) (انظر الخطوات 3،1-3،5).
ملاحظة: هذه الطريقة من التخدير يسمح التصوير كل 5 أيام. لأداء وتصوير يومي، وهو الأسلوب الذي يستخدمه الأيزوفلورين كما هو مطلوب مخدر وتصوير تلألؤ بيولوجي مناسبة للاستخدام مع هذا المخدر. - الحصول على صور الأمامية والخلفية للحيوان، وذلك باستخدام ميزة لصناعة السيارات في التعرض، كما هو الحال في الخطوات 5.5) و 5.6). التعامل مع الماوس كما في الخطوة 5.7).
7. ضوء بارد الكمي وتحليل الصور
ملاحظة: وتستند هذه الطريقة luminoscore على تحليل سياسي صورةالصورة. مرة واحدة وقد تم الحصول على الصور وفقا للخطوات أعلاه، فإن القياس الكمي لا يمكن أن يؤديها في أي وقت (بما في ذلك مباشرة بعد الاستحواذ)، لربط luminoscore إلى كل فأر في كل نقطة زمنية.
- عرض "أداة لوحة" عن طريق النقر على "عرض" ثم انقر على "أداة لوحة" إذا لم يتم عرض بالفعل. انقر على "أداة العائد على الاستثمار" علامة التبويب لوحة أداة. اختر زر "كونتور" ثم حدد "التعادل مجاني".
- بمناسبة يدويا المنطقة ذات الاهتمام (ROI) في جميع أنحاء الماوس وذلك باتباع حواف الماوس على المشهد الأمامي. إغلاق كفاف مع الحق في الضغط على فأرة الكمبيوتر.
- انقر على "عرض" ثم "قياسات العائد على الاستثمار". تأكد "راديانس (الفوتونات)" محددا في "أنواع القياس" القائمة التمرير على الجزء السفلي الأيسر من النافذة "قياسات العائد على الاستثمار". إن لم يكن، حدده. ثم قياس الفوتون فلوريداUX (الرقم الهيدروجيني / ق) عن طريق تسجيل القيمة في "مجموع الجريان [/ ق ص]" مربع.
ملاحظة: لا تستخدم التألق أو أي وحدة أخرى نسبة إلى مساحة العائد على الاستثمار. - كرر الخطوات من 7.2) و 7.3) للعرض مرة أخرى.
- جمع القيم تدفق اثنين الفوتون التي تم الحصول عليها من الأمام وعرض الخلفي. والنتيجة هي luminoscore.
- مقارنة القيم لكل مجموعة باستخدام اختبار إحصائيات المناسب (ثنائي الطرف غير حدودي مان ويتني اختبار، على سبيل المثال) 14.
Representative Results
طريقة Luminoscore يمكن أن تستخدم للتحقق من حقن خلايا الأورام
في النماذج التي تنطوي على حقن من عدد قليل من الخلايا السرطانية أو عندما لا يسمح موقع الحقن التحقق البصري للحقن، ويمكن أن يكون من الصعب جدا لضمان جودة من الحقن. يقدم طريقة luminoscore كأداة سريعة ومريحة للتحقق من جودة الإجراءات والتأكد بسهولة وعلى الفور أن كل شيء يسير على حق. في كلا النموذجين، الورم قابلا للاكتشاف في وقت مبكر من 10 دقيقة بعد الحقن (الشكل 1A). الصور تكفي وحدها للتحقق من أن الخلايا السرطانية موجودة في الموقع الصحيح. ومع ذلك، قياس الصور يعطي فكرة عدم تجانس الحقن. النقطة مؤامرة (الشكل 1B) يظهر بوضوح الفرق بين الحيوانات التي تلقت (النقاط السوداء) ولم إعادةceive (خط أحمر) الحقن. ومن المثير للاهتمام، إشارة تم الحصول عليها في نموذج SCL أعلى 100 مرة مما كانت عليه في نموذج PIOL. وتتوافق هذه النتيجة مع عدد من حقن الخلايا (5 × 10 6 و 1 × 10 4 خلايا، على التوالي).
الشكل 1. التأكيد من الحقن في مختلف نماذج الماوس الغدد اللمفاوية، وluminoscores قياس 10 دقيقة بعد التلقيح الخلايا السرطانية في سرطان الغدد الليمفاوية نماذج مختلفة. (A) صور الممثل كلا النموذجين. (ب) Luminoscore من كل حيوان في نماذج مختلفة. الخط الأحمر يتوافق مع ضجيج في الخلفية يعني يقاس على 10 الحيوانات قبل التلقيح الخلايا السرطانية. الخطوط المنقطة هي متوسط +/- الانحراف المعياري. لكل نموذج، كل الحيوانات يمكن تمييزها من الضوضاء في الخلفية. في نموذج PIOL، كانت 1 × 10 4 خلايا شركة النفط الوطنية العراقيةulated في الجسم الزجاجي للعين اليمنى، وفي نموذج SCL، 5 × 10 6 خلايا تحت الجلد في كل جناح من الفأرة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
مراقبة عبء الورم والاستجابة للعلاج
وluminoscore هو أيضا أداة قوية لدراسة نمو الورم وفعالية العلاج. ويبين الشكل 2A صور تمثيلية لرصد نمو الورم في التحكم والدليل السياسي الشامل المجموعات المعالجة PIOL. تم تلقيح الفئران مع 1 × 10 4 الخلايا السرطانية لكل منهما، وكانت تدار العلاج في الموقع في يوم 7. وتظهر الصور التي بعد مرور فترة زمنية كافية (28 يوما)، وبدأت الانبثاث في الظهور في المجموعة الضابطة. على الرغم من أن الورم الرئيسي لم تظهر حساسية للعلاج، أقلوقد لوحظت الانبثاث في المجموعة التي تلقت العلاج الدليل السياسي الشامل (الجدول 1). التحليل الكمي للعبء الورم في كل مجموعة (الشكل 2B) أن الدليل السياسي الشامل تباطأ نمو الورم، مما ينتج عنه فروق ذات دلالة إحصائية بين المعالجة والسيطرة على المجموعة بعد 28 يوما (غير حدودي الذيل يومين اختبار مان ويتني ع = 0.0079 ). ومع ذلك، فإن الورم لا يزال نمت في الفئران التي عولجت، واحدا منهم على قيد الحياة (لا تظهر البيانات). وتتوافق هذه النتيجة مع التقارير السابقة: الدليل السياسي الشامل ليس له آثار كبيرة على أورام العين الابتدائية 10. تأثير الكبير الذي لدينا هنا بين ODN وجماعة الدليل السياسي الشامل يأتي من تثبيط نمو ورم خبيث.
الشكل 2. رصد عبء الورم والاستجابة للعلاج. (A) صور الممثل المجموعتين (ODN السيطرة والدليل السياسي الشامل المعاملة) سو PIOL الحاملة للفئران. عبء الورم (ب) رصد مع luminoscore. كما نشاهد في مؤامرة نقطة، وتأثير الدليل السياسي الشامل على luminoscore مهم في يوم 28. في هاتين الفئتين، فإن هذه الطريقة من الممكن لمراقبة عبء الورم ولقياس (ع = 0.0079) تأثيرات طفيفة ولكنها هامة من CpG- الحمض النووي، والتي يمكن أن تكون قد تم الكشف عن الصور وحدها. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| المجموعات | فأر | وجود نقائل | موقع | الفوتون تدفق (الرقم الهيدروجيني / ث) |
| الدليل السياسي الشامل | 1 | لا | X | X |
| 2 | نعم فعلا | 9.32E + 05 | ||
| 3 | لا | X | X | |
| 4 | لا | X | X | |
| 5 | نعم فعلا | عقدة lymp استنزاف العين | 2.21E + 07 | |
| ODN | 1 | نعم فعلا | عقدة lymp استنزاف العين | 1.06E + 07 |
| 2 | نعم فعلا | عقدة lymp استنزاف العين | 7.25E + 07 | |
| 3 | نعم فعلا | عقدة lymp + جانب المقابل استنزاف العين | 7.64E + 08 | |
| 4 | نعم فعلا | عقدة lymp + جانب المقابل استنزاف العين | 1.74E + 09 | |
| 5 | نعم فعلا | عقدة lymp + جانب المقابل استنزاف العين | 9.76E + 07 |
الجدول 1. Tانه Luminoscore الطريقة يمكن تكييفها لاتباع نهج مختلفة
طريقة luminoscore لا يقتصر على نوع واحد من نموذج الفأر. ويوضح الشكل 3، أنه يمكن تكييفها لنماذج مختلفة الماوس. في نموذج SCL، والمطعمة اثنين من الأورام على كل جانب من الفأرة. يدار علاج في الموقع إلى جانب واحد في اليوم 0، ويخدم الورم المقابل كما سيطرتها (الشكل 3A). لذلك، وضعت اثنين من العائد على الاستثمار في الماوس: واحد لكل جانب (الشكل 3C). النسبة بين luminoscore على الجانبين المعالجة والسيطرة يصف بالطبع النسبي لكل الورم. تم تعيين هذه النسبة إلى 1 في اليوم 0، عندما كانت تدار العلاج. لاحظنا انخفاضا كبيرا في هذه النسبة بعد 13 يوما إدارة العلاج (الشكل 3D، الذيل يومين غير حدودي مان ويتني اختبار ع = 0.004). هذا الانخفاض يكشف أن معاملة الجانب الورموقد resorbed، كما هو موضح في الصور تلألؤ بيولوجي التمثيلية (الشكل 3B).
الشكل 3. التكيف من أسلوب Luminoscore إلى نموذج مع اثنين من مواقع الورم الرئيسي. (أ) التصميم التجريبي لفحص SCL. تم حقن الفئران مع اثنين من الأورام الأولية في كل جناح. يتم حقن جانب واحد مع أي الدليل السياسي الشامل الحمض النووي أو ODN السيطرة، وعلى الجانب الآخر مع برنامج تلفزيوني، لتكون بمثابة سيطرتها. (ب) كانت تدار صور الممثل الفئران المعاملة الدليل السياسي الشامل والتحكم في اليوم 0 ويوم 13. العلاج في اليوم الذي أعاق 0. نمو الورم في الجانب المعالج الدليل السياسي الشامل للماوس. (C) ووضع علامة عليها يدويا حتى المناطق ذات الاهتمام لكل حيوان لمدة مواقع الورم الرئيسي. (D) والنسبة بين luminoscores من الدليل السياسي الشامل المعاملة أو الجانب ODN مراقبة وسيطرة الجانب PBS هو مؤشر أنيعكس النمو النسبي لكل ورم في نفس الحيوان. تم تعيين هذه النسبة إلى 1 في اليوم 0. في يوم 13، ونسبة من المجموعة التي تلقت العلاج الدليل السياسي الشامل، انخفضت بشكل ملحوظ (ع = 0.004)، وكشف عن تثبيط نمو الورم عن طريق إدارة الموقع في الدليل السياسي الشامل من الحمض النووي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
امتصاص الضوء من قبل الأعضاء والأنسجة يبقى وجود قيود على التصوير تلألؤ بيولوجي، على الرغم من أن هذا التحديد متأصل في أي طريقة التصوير الضوئي. في سياق نهجنا، ومن المتوقع أن يكون تقلب منخفض شريطة أن يتم إجراء دراسات في نموذج معين (الموقع وحبلا الماوس)، مما يسمح للثم مقارنات آثار الهياكل التشريحية على luminoscore. تلألؤ بيولوجي لا يحتاج ضوء الإثارة، وبالتالي هو أكثر تتكيف مع الجسم كله في التصوير المجراة من مضان.
التحليل المكاني هو أيضا وجود قيود على التصوير تلألؤ بيولوجي، ويبقى الموقع الدقيق للجهاز من التي تنبعث الفوتونات تلألؤ بيولوجي الصعب. ومع ذلك، معرفة جيدة من نموذج يمكن أن تساعد في الموقع النوعي للمواقع الأورام. الناتج الوحيد في هذه الطريقة على أساس تلألؤ بيولوجي هو luminoscore. الموقع لا تؤثر على luminoscore لأن علامة المتابعة اليدوية منطقة الاجتذاب الأموالر (ROI) ويشمل الماوس كله. وأخيرا، يراعة وسيفيراز تتطلب الأوكسجين. وفقا لذلك، والتصوير تلألؤ بيولوجي عادة يقلل الأورام الميتة. مرة أخرى، لا بد من معرفة جيدة لهذا الجانب من النموذج.
في هذه الورقة، ونحن لا تهدف إلى تقييم فعالية الدليل السياسي الشامل باعتباره دواء مضاد للأورام (الذي سبق أن أثبتت 7،9،11) ولكن لوصف طريقة السماح للمقارنة بين مجموعات البيانات تلألؤ بيولوجي. وصفنا في الواقع وسيلة لقياس عبء ورم تهدف الى المساعدة في توحيد بروتوكول الاستحواذ لمقارنة فحوصات مختلفة في أماكن مختلفة في أوقات مختلفة، والتي لا تتطلب حسابات الكمبيوتر. لضمان استنساخ والصحيح الكمي الفوتون تدفق، ويجب معايرة جهاز التصوير مع إشارة ضوئية لأجهزة محلية الصنع أو على النحو الموصى به من قبل مزود لأجهزة التجارية.
يتطلب بروتوكول اهتمامنا دقيق لعدة ص حرجةoints: (ط) أولا، ونوعية التخدير الماوس أمر حاسم للحصول على صور واضحة، خصوصا في الحالات مع أوقات التعرض الطويل. (ب) يجب أن تكون وحدة القياس الكمي دائما أن يكون تدفق الفوتون لإشعاع يعتمد على مساحة كل فأر وقد تكون في غير محلها لمقارنة الفئران مختلفة. (ج) يجب أن لا يحتوي الصور تلألؤ بيولوجي بكسل المشبعة، لأن هذه من شأنه انحياز luminoscore. (د) يطلب العودة واكتساب الأمامي لجمع كل الفوتونات المنبعثة من موقع الورم (أي اكتساب الأمامي قد لا يكشف بالضرورة الفوتونات من الجزء الخلفي من ورم). تم اختبار العديد من الرسومات العائد على الاستثمار المختلفة خلال تطوير أسلوب luminoscore. فقط دليل علامة المتابعة أثمرت نتائج مرضية التي يرجح أن تكون ذات دلالة إحصائية (لا تظهر البيانات).
اينو وآخرون. يوصي جرعة وسيفيرين من 75 ملغم / كغم 13. باستخدام جرعة 150 ملغم / كغم بدلا من ذلك، فإن توقيت التصوير بعدلا تزال إدارة وسيفيرين دون تغيير، وعلينا أن نضمن أن الهضبة تدوم طوال اكتساب التعرض لفترة طويلة. يجب أن يكون وسيفيرين المتفاعلة الزائدة طوال عملية الاستحواذ. اعتمادا على نموذج، المنطقة ذات الاهتمام يمكن تكييفها، كما فعلنا في نموذج SCL حيث تعادلنا اثنين من العائد على الاستثمار لكل حيوان. وفي نموذج SCL، يتم حقن العلاج عندما يصل الورم 0.5 سم في أكبر قطر للحد من التقلبات من engraftment. اعتمادا على الفئران، والورم قد نمت بشكل مختلف. لتوحيد ومقارنة الفئران، قررنا استخدام النسبة بين الجانب المعالج وغير المعالجة التي تكشف عن النمو النسبي لكلا الجناحين الأورام.
إذا لوحظ أي إشارة من الماوس حقن المتوقع أن تكون إيجابية، إما (ط) عدد الخلايا منخفض جدا وإشارة أقل من عتبة الكشف. أو (ب) الماوس يفتقر إلى الأكسجين ويتطلب عناية فورية.
العديد من bioluminesc الكميةسينعقد التحليلات التي وصفها الكتاب المختلفة تتطلب حسابات معقدة وأدوات (على سبيل المثال، 3D التصوير المقطعي تلألؤ بيولوجي) للاقتراب من تقدير المطلق من الفوتونات المنبعثة تلألؤ بيولوجي 5،15. لا يوجد إجماع على طريقة لقياس تلألؤ بيولوجي بتكاثر، خصوصا في نماذج الورم، مع تصوير تلألؤ بيولوجي 2D. كان هدفنا هو توحيد بروتوكول الحصول على الصور للحد من المستخدمين الاعتماد.
حقن الدليل السياسي الشامل في الموقع بعد التلقيح الورم خفض عبء الورم في كلا النموذجين. طريقة luminoscore يمكن أن تكون بمثابة أداة لمراقبة عبء الورم في نماذج أخرى من المناعية الورم. مراقبة عبء الورم يوفر طريقة موسع التي يمكن أن تحسن فهمنا لنمو الورم وآليات نقيلي دون التدخل في المكروية الورم. ويتعزز تحديد الحيوانات التي تفعل ولا تستجيب للعلاج بهذه الطريقة من قبل التحقق من الصورةuccessful حقن الخلايا السرطانية في بداية التجربة.
نحن هنا أظهر القدرة على التكيف من طريقة luminoscore في نموذج SCL باستخدام خلايا A20.IIA-luc2. ومع ذلك، يمكن تكييف هذه الطريقة لأي نموذج الورم الآخرين الذين يستخدمون خطوط الخلايا الأخرى بشرط أن التعبير عن وسيفيراز، أو في سياق الدراسات خلايا T (ورم محددة الخلايا التائية السامة للخلايا والتنظيمية خلايا تي، وما إلى ذلك). ويمكن أيضا أن يتم رصد في الجسم الحي نقل الجينات في سياق العلاج الجيني لمرض نادر باستخدام طريقة luminoscore.
أخيرا تظهر البيانات أن طريقة luminoscore القائم على تلألؤ بيولوجي يمكن المقارنة بين التجارب، ويوفر المرونة والقدرة على التكيف مع احتياجات تجريبية محددة، ويشكل وسيلة مفيدة لدراسات ما قبل السريرية طولية موسع.
Acknowledgments
نشكر مرافق الحيوانية من مركز كوردولييه البحوث (مركز دراسات الحدود، باريس، فرنسا)، Genethon (إيفري، فرنسا) وGenopole (CERFE، إيفري، فرنسا). نشكر جو آن كاهن لها قراءة متأنية للمخطوطة. وأيد هذا البحث من قبل المعهد الوطني للسانتيه إت دي لا Rechercher ميديكال، جامعة باريس ديكارت، بيار وماري جامعة كوري، جمعية صب لا بحوث مناهضة جنيه السرطان، والاتجاه التونسي جنرال للبحوث العلميه، CMCU فرانكو التونسي المشروع، وتطبيقات Thématiques Incitatives دي Genopole (ATIGE) الأموال. وأيد JC من حدود في مدرسة علوم الحياة الدكتوراه والزمالة من الإنكا (المعهد الوطني للسرطان). وكان بنك الاحتياطي الأسترالي المستفيدة من المنح المقدمة من DGRS-INSERM وCMCU. تلقى SD منحة من المعهد الوطني للسرطان.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CpG 1826 | Invivogen | Sequence: 5_-TCCATGACGTTCCTGACGTT Catalog number: tlrl-1826 |
|
| ODN 1826 control | Invivogen | Sequence: 5_-TCCATGAGCTTCCTGAGCTT Catalog number: tlrl-1826c |
|
| D-luciferin potassium salt | Interchim | Catalog number: FP-M1224D | |
| Ketamin | Virbac, France | ||
| Xylazin | Bayer Healthcare | Rompun 2% | |
| A20.IIA-luc2 cell line | A20.IIA transfected with pGL4.50[luc2/CMV/hygro]7 (Promega E1310) |
||
| Mice | Balb/cByj | Six-weeks old females from Charles River | |
| IVIS lumina Biolumienscence imager | Perkin Elmer | ||
| Living Image software | Perkin Elmer | Used for measuring photon flux on images and drawing ROIs | |
| R software (opensource) | R-project | Used for statistic tests | |
| Hamilton Precision Serynge 10 µl | Hamilton | Product number 7642-01100 | |
| Eye ointment | Lacrinorm | ||
| Dissecting microscope | ZEISS | Stemi 305 |
References
- Rehemtulla, A., et al. Rapid and Quantitative Assessment of Cancer Treatment Response Using In Vivo Bioluminescence Imaging. Neoplasia. 2 (6), New York, N.Y. 491-495 (2000).
- Edinger, M., et al. Advancing animal models of neoplasia through in vivo bioluminescence imaging. European Journal of Cancer. 38 (16), Oxford, England. 2128-2136 (2002).
- Hastings, J. W., Gibson, Q. H. The Role of Oxygen in the Photoexcited Luminescence of Bacterial Luciferase. Journal of Biological Chemistry. 242 (4), 720-726 (1967).
- Inouye, S., Shimomura, O. The Use of Renilla Luciferase, Oplophorus Luciferase, and Apoaequorin as Bioluminescent Reporter Protein in the Presence of Coelenterazine Analogues as Substrate. Biochemical and Biophysical Research Communications. 233 (2), 349-353 (1997).
- Pesnel, S., et al. Quantitation in Bioluminescence Imaging by Correction of Tissue Absorption for Experimental Oncology. Molecular Imaging and Biology. 13 (4), 646-652 (2010).
- Corre, G., et al. Stochastic Fluctuations and Distributed Control of Gene Expression Impact Cellular Memory. PLoS ONE. 9 (12), (2014).
- Ben Abdelwahed, R., et al. Lymphoma B-cell responsiveness to CpG-DNA depends on the tumor microenvironment. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research CR. 32 (1), 18 (2013).
- Abdelwahed, R. B., et al. Preclinical Study of Ublituximab, a Glycoengineered Anti-Human CD20 Antibody, in Murine Models of Primary Cerebral and Intraocular B-Cell Lymphomas. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (5), 3657-3665 (2013).
- Donnou, S., Galand, C., Touitou, V., Sautès-Fridman, C., Fabry, Z., Fisson, S. Murine Models of B-Cell Lymphomas: Promising Tools for Designing Cancer Therapies. Advances in Hematology. 2012, (2012).
- Qi, X. -F., et al. CpG oligodeoxynucleotide induces apoptosis and cell cycle arrest in A20 lymphoma cells via TLR9-mediated pathways. Molecular Immunology. 54 (3-4), 327-337 (2013).
- Houot, R., Levy, R. T-cell modulation combined with intratumoral CpG cures lymphoma in a mouse model without the need for chemotherapy. Blood. 113 (15), 3546-3552 (2009).
- Krieg, A. M. Toll-like receptor 9 (TLR9) agonists in the treatment of cancer. Oncogene. 27 (2), 161-167 (2008).
- Inoue, Y., Kiryu, S., Watanabe, M., Tojo, A., Ohtomo, K. Timing of Imaging after D-Luciferin Injection Affects the Longitudinal Assessment of Tumor Growth Using In Vivo Bioluminescence Imaging. International Journal of Biomedical Imaging. 2010, (2010).
- Mann, H. B., Whitney, D. R. On a Test of Whether one of Two Random Variables is Stochastically Larger than the Other. Annals of Mathematical Statistics. 18 (1), 50-60 (1947).
- Darne, C., Lu, Y., Sevick-Muraca, E. M. Small animal fluorescence and bioluminescence tomography: a review of approaches, algorithms and technology update. Physics in Medicine and Biology. 59 (1), 1 (2014).
