Bioluminescens billeddannelse er en velkendt værktøj til lokalisering af tumorer og metastaser, men kvantificering af disse billeder kræver ofte komplicerede beregninger og bestemte instrumenter. Vi beskriver den nemme at bruge luminoscore metode, baseret på præcise betingelser erhvervelse, der kræver ingen beregninger, og gør det muligt for tumor byrde og behandlingsrespons skal overvåges i musemodeller.
Although bioluminescence imaging (BLI) shows promise for monitoring tumor burden in animal models of cancer, these analyses remain mostly qualitative. Here we describe a method for bioluminescence imaging to obtain a semi-quantitative analysis of tumor burden and treatment response. This method is based on the calculation of a luminoscore, a value that allows comparisons of two animals from the same or different experiments. Current BLI instruments enable the calculation of this luminoscore, which relies mainly on the acquisition conditions (back and front acquisitions) and the drawing of the region of interest (manual markup around the mouse). Using two previously described mouse lymphoma models based on cell engraftment, we show that the luminoscore method can serve as a noninvasive way to verify successful tumor cell inoculation, monitor tumor burden, and evaluate the effects of in situ cancer treatment (CpG-DNA). Finally, we show that this method suits different experimental designs. We suggest that this method be used for early estimates of treatment response in preclinical small-animal studies.
Tidlig opdagelse tumorceller fortsat en udfordring og er afgørende for at øge kræftbehandling effektivitet. In vivo bioluminescens imaging (BLI) er en meget følsom, noninvasive optisk teknik, i vid udstrækning anvendes til overvågning af tumorer i små dyr. Ildflueluciferase-udtrykkende celler anvendes almindeligvis til sådanne forsøg 1,2. Denne oxygenase oxiderer D-luciferin med molekylært oxygen men kræver to cofaktorer – Mg 2+ og adenosintriphosphat 3. Ildflueluciferase er mere egnet til in vivo-billeddannelse end renilla luciferase 4 fordi dens kvanteudbytte er højere.
Den oxiderede substrat – oxyluciferin – spontant udsender en foton at vende tilbage til dens grundlæggende tilstand og derefter bliver inaktiv. De udsendte fotoner har en maksimal bølgelængde omkring 530 nm. En høj følsomhed Kameraet kan registrere de luminescerende fotoner fra indersiden af et lille dyr og levere billeder, der gør det POSSsible at lokalisere tumorceller.
Evnen til at kvantificere tumorbelastning præcist ved fotontællinger kunne tjene som et effektivt og følsomt værktøj til kvantificering behandlingseffekt. Fordi behandlingseffekt kan påvises tidligere, kunne denne følsomhed gør det muligt at bestemme det nøjagtige tidspunkt, hvor en behandling bliver effektiv.
Absolut kvantificering af totale udsendte fotoner er meget kompleks. Antallet af fotoner indsamlet afhænger af dybden af tumoren og organer fotonerne udsendes igennem. Justeringskoefficienter baseret på væv absorptionskoefficienter kan beregnes 5, men den absolutte kvantificering af tumor celleantal kræver kende antallet af fotoner, der udsendes af hver tumor celle. Desuden luciferaseekspressionen, ligesom mange reportergener (fx., Fluorescerende proteiner) ikke er homogen, selv i en cellepopulation afledt af en enkelt klon 6. Antallet af luciferASE proteiner i cellerne kan ikke beregnes præcist. Etableringen af standardiserede forsøgsbetingelser synes derfor afgørende for en pålidelig semi-kvantitativ analyse.
Vi anvendte luminoscore metode til to forskellige mus lymfom modeller 7,8,9. I disse modeller er syngene tumorceller injiceres i øjet eller under huden for at opnå henholdsvis en primær intraokulær lymfom (Piol) model og en subkutan lymfom (SCL) model. I hvert af disse ortotopisk modeller, er behandlingen administreres in situ, syv dage efter inokulation af tumor for Piol og når tumoren har nået 0,5 til 0,7 cm i sin største diameter for SCL.
Vi brugte luminoscore metode til at overvåge virkningerne af di situ CpG terapi, tidligere vist sig at være effektiv 7,10,11. CpG er en oligonukleotidsekvens og en ligand af TLR9, som igen er en intracellulær receptor udtrykt ved talrige ceLLS i immunsystemet, herunder dendritiske celler, B-lymfocytter, monocytter og naturlige dræberceller. CpG-DNA er et 20-mer DNA-sekvens, der indeholder CpG (CG) immunstimulerende motiv; kontrollen (ODN-kontrol) er den samme 20-mer DNA-sekvens, bortset fra at det immunstimulerende CG-sekvensen er inverteret (GC). TLR9 engagement i den murine lymfom vi studerer inducerer apoptose 10, aktiverer immunforsvaret 12, og derved reducerer tumorbelastning 7,11 betydeligt.
Her beskriver vi en standardiseret metode til kvantificering tumor byrde og behandlingsrespons gennem selvlysende billeder. Denne metode bygger på forskellige aspekter af imaging procedure, fra køb til analyse, for at optimere pålidelighed, reproducerbarhed, ikke-brugeren afhængighed, og statistisk signifikans. En bioluminescens kvantificering indeks henføres til hvert mus; denne værdi, som vi kalder en luminoscore, kan sammenlignes ikke kun mellem dyr, men alså mellem eksperimenter.
I dette arbejde har vi fokus på den billeddannende procedure bioluminescens samt billedet kvantificering af luminoscore metoden. Vi viser effektiviteten af denne metode til kontrol af injektionen, overvågning tumor byrde, og vurdere effekten af in situ kræftbehandling. Hvert af disse punkter er illustreret i repræsentative resultater fra forsøg med forskellige musemodeller for at fremhæve tilpasningsevne luminoscore metode.
Lysabsorption organer og væv er fortsat en begrænsning af bioluminescens imaging, selv om denne begrænsning er uløseligt forbundet med enhver optisk billeddannelse modalitet. I forbindelse med vor strategi, forventes virkningerne af anatomiske strukturer på luminoscore at have lav variabilitet forudsat at undersøgelser udføres i en given model (placering og muse-streng), hvilket muliggør derefter sammenligninger. Bioluminescens behøver ikke excitationslys og dermed er mere tilpasset hele kroppen in vivo billeddannelse end fluorescens.
Rumlig opløsning er også en begrænsning af bioluminescens imaging, og præcis placering af orglet, hvorfra bioluminescens fotoner udsendes fortsat vanskelig. godt kendskab til modellen, kan imidlertid hjælpe i den kvalitative placering af tumor sites. Den eneste udgang i denne bioluminescens-baserede metode er luminoscore. Placering påvirker ikke luminoscore fordi den manuelle mark-up Region Interest (ROI) dækker hele mus. Endelig ildflueluciferase kræver oxygen. Følgelig bioluminescens billeddannelse sædvanligvis undervurderer nekrotiske tumorer. Endnu en gang er et godt kendskab til dette aspekt af modellen kræves.
I dette papir, er vi ikke det formål at vurdere effekten af CpG som et anti-tumor lægemiddel (som allerede er påvist 7,9,11), men for at beskrive en fremgangsmåde, der muliggør sammenligning af bioluminescens datasæt. Vi beskriver faktisk er en metode til at kvantificere tumorbelastning skal hjælpe standardisere erhvervelse protokol for sammenligning af forskellige assays på forskellige steder på forskellige tidspunkter og som ikke kræver computerberegninger. For at sikre reproducerbarhed og korrekt fotonflux kvantificering, skal den billeddannende enhed kalibreres med en let reference for hjemmelavede enheder eller som anbefalet af leverandøren til kommercielle enheder.
Vores protokol kræver omhyggelig opmærksomhed på flere kritiske points: (i) det første er kvaliteten af musen anæstesi er afgørende for at opnå klare billeder, især i tilfælde med tider lang eksponering. (Ii) Kvantificeringen Enheden skal altid være fotonflux fordi udstråling afhænger af overfladearealet af hver mus og kan være irrelevant for sammenligning af forskellige mus. (Iii) De bioluminescens billeder må ikke indeholde mættede pixels, fordi disse ville bias luminoscore. (iv) Ryg- og erhvervelse er forpligtet til at indsamle alle fotoner, der udsendes fra tumor (dvs. kan forreste erhvervelse ikke nødvendigvis afsløre fotoner fra bagsiden af tumor). Forskellige forskellige investeringsafkast tegninger blev testet under udviklingen af den luminoscore metoden. Kun den manuelle mark-up givet tilfredsstillende resultater, der er mere tilbøjelige til at være statistisk signifikant (data ikke vist).
Inoue et al. anbefaler en luciferin dosis på 75 mg / kg 13. Ved anvendelse af en dosis på 150 mg / kg i stedet, timingen af billeddannelse efterluciferin administration forbliver uændret, og vi sikrer, at plateauet varer hele en erhvervelse lang eksponering. Luciferin skal være den overskydende reaktant hele købsprocessen. Afhængigt af modellen, kan området af interesse tilpasses, som vi viste i SCL model, hvor vi trak to ROI pr dyr. I SCL model, er behandlingen injiceres når tumoren når 0,5 cm i sin største diameter for at begrænse variabilitet af transplantation. Afhængigt musene, kunne tumoren er vokset forskelligt. At standardisere og sammenlign mus, besluttede vi at bruge et forhold mellem behandlede og ikke-behandlede side, der afslører den relative vækst af begge flanker tumorer.
Hvis der ikke observeres signal fra en injiceret mus forventes at være positiv, enten (i) antallet af celler er meget lav, og signalet er under detektionsgrænsen; eller (ii) musen mangler oxygen og kræver øjeblikkelig behandling.
Flere af den kvantitative bioluminescdelse analyser beskrevet af forskellige forfattere kræver komplekse beregninger og instrumenter (f.eks 3D bioluminescens tomografi) at nærme sig den absolutte kvantificering af udsendes bioluminescens fotoner 5,15. Der er ikke enighed om en metode til kvantificering bioluminescens reproducerbart, især i tumormodeller, med en 2D-bioluminescens imager. Vores mål var at standardisere købet billedet protokollen til at begrænse brugeren afhængighed.
Injektionen af CpG in situ efter podning med tumoren reduceret tumorbelastning i begge modeller. Den luminoscore metode kan tjene som et værktøj til at overvåge tumor byrde i andre modeller af tumor immunterapier. Overvågning tumorbyrde giver en noninvasiv metode, der kan forbedre vores forståelse af tumorvækst og metastasering mekanismer uden at forstyrre tumor mikromiljø. Identifikationen af dyr, der gør, og ikke reagerer på behandling med denne metode forstærkes af verifikation af successful tumorcelleinjektion ved begyndelsen af eksperimentet.
Vi her viste tilpasningsevne luminoscore metoden i en SCL model ved hjælp af A20.IIA-luc2 celler. Imidlertid kan denne fremgangsmåde tilpasses til enhver anden tumormodel anvendelse af andre cellelinjer, forudsat at de udtrykker luciferase, eller i forbindelse med T-celle-undersøgelser (tumorspecifik cytotoksiske T-celler, regulatoriske T-celler, etc.). Overvågningen af in vivo-genoverførsel i forbindelse med genterapi af sjældne sygdomme kan også gøres ved hjælp af luminoscore metode.
Endelig viser de data, som bioluminescens-baserede luminoscore metode muliggør sammenligninger mellem eksperimenter, giver fleksibilitet og tilpasningsevne til specifikke eksperimentelle behov, og er et nyttigt værktøj til invasive langsgående prækliniske undersøgelser.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker dyret faciliteterne i Cordelier Research Center (CEF, Paris, Frankrig), Généthon (Evry, Frankrig) og Genopole (CERFE, Evry, Frankrig). Vi takker Jo Ann Cahn for hendes omhyggelig læsning af manuskriptet. Denne forskning blev støttet af Institut National de la Santé et de la Rechercher Médicale, Paris Descartes University, Pierre & Marie Curie Universitet, Foreningen pour la Recherche contre le Cancer, den tunesiske Direction Générale de la Recherche Scientifique, den fransk-tunesiske CMCU projekt, og de aktioner Thématiques Incitatives de Genopole (ATIGE) midler. JC blev støttet af Frontiers in Life Science ph.d. skole og et stipendium fra INCA (Institut National du Cancer). RBA var en modtager af tilskud fra DGRS-INSERM og CMCU. SD modtaget en bevilling fra Institut National du Cancer.
CpG 1826 | Invivogen | Sequence: 5_-TCCATGACGTTCCTGACGTT Catalog number: tlrl-1826 |
|
ODN 1826 control | Invivogen | Sequence: 5_-TCCATGAGCTTCCTGAGCTT Catalog number: tlrl-1826c |
|
D-luciferin potassium salt | Interchim | Catalog number: FP-M1224D | |
Ketamin | Virbac, France | ||
Xylazin | Bayer Healthcare | Rompun 2% | |
A20.IIA-luc2 cell line | A20.IIA transfected with pGL4.50[luc2/CMV/hygro]7 (Promega E1310) |
||
Mice | Balb/cByj | Six-weeks old females from Charles River | |
IVIS lumina Biolumienscence imager | Perkin Elmer | ||
Living Image software | Perkin Elmer | Used for measuring photon flux on images and drawing ROIs | |
R software (opensource) | R-project | Used for statistic tests | |
Hamilton Precision Serynge 10µL | Hamilton | Product number 7642-01100 | |
Eye ointment | Lacrinorm | ||
Dissecting microscope | ZEISS | Stemi 305 |