Biolumineszenz-Bildgebung ist ein bekanntes Werkzeug für Tumoren und Metastasen zu lokalisieren, aber Quantifizierung dieser Bilder erfordert oft komplexe Berechnungen und bestimmte Instrumente. Wir beschreiben die einfach zu bedienende luminoscore-Methode, basierend auf genauen Aufnahmebedingungen, keine Berechnungen erfordern, und ermöglicht die Tumorlast und Ansprechen auf die Behandlung in Mausmodellen beobachtet werden.
Although bioluminescence imaging (BLI) shows promise for monitoring tumor burden in animal models of cancer, these analyses remain mostly qualitative. Here we describe a method for bioluminescence imaging to obtain a semi-quantitative analysis of tumor burden and treatment response. This method is based on the calculation of a luminoscore, a value that allows comparisons of two animals from the same or different experiments. Current BLI instruments enable the calculation of this luminoscore, which relies mainly on the acquisition conditions (back and front acquisitions) and the drawing of the region of interest (manual markup around the mouse). Using two previously described mouse lymphoma models based on cell engraftment, we show that the luminoscore method can serve as a noninvasive way to verify successful tumor cell inoculation, monitor tumor burden, and evaluate the effects of in situ cancer treatment (CpG-DNA). Finally, we show that this method suits different experimental designs. We suggest that this method be used for early estimates of treatment response in preclinical small-animal studies.
Frühe Tumorzelldetektion bleibt eine Herausforderung und ist von entscheidender Bedeutung für die Krebsbehandlung Wirksamkeit verbessert wird . In – vivo – Biolumineszenz – Bildgebung (BLI) ist eine sehr empfindliche, nicht – invasive optische Technik, die weithin für die Überwachung von Tumoren bei Kleintieren eingesetzt. Glühwürmchen – Luciferase-exprimierenden Zellen werden für solche Experimente 1,2 verwendet. Diese Oxygenase oxidiert D-Luciferin mit molekularem Sauerstoff erfordert jedoch zwei Cofaktoren – Mg 2+ und Adenosintriphosphat 3. Glühwürmchen – Luciferase ist besser geeignet für di – vivo – Bildgebung als Renilla – Luciferase 4 , weil seine Quantenausbeute höher ist .
Das oxidierte Substrat – Oxyluciferin – emittiert spontan ein Photon zu seiner fundamentalen Zustand zurückzukehren und dann inaktiv wird. Die emittierten Photonen haben eine maximale Wellenlänge um 530 nm. Eine hochempfindliche Kamera kann die Leuchtphotonen von der Innenseite eines kleinen Tieres erfassen und Bilder liefern, die es POSS machenIVK Tumorzellen zu lokalisieren.
Die Fähigkeit, Tumorlast genau durch Photonenzählungen dienen zur Quantifizierung der Wirksamkeit der Behandlung als leistungsfähiges und empfindliches Werkzeug könnte zu quantifizieren. Weil Behandlungseffekte früher erkannt werden, kann diese Empfindlichkeit machen es möglich, den genauen Zeitpunkt zu bestimmen, an dem eine Behandlung wirksam wird.
Absolute Quantifizierung der gesamten emittierten Photonen ist sehr komplex. Die Anzahl der Photonen hängt von der Tiefe des Tumors gesammelt und auf die Organe durch die Photonen emittiert werden. Korrekturkoeffizienten basierend auf Gewebeabsorptionskoeffizienten können 5, aber die absolute Quantifizierung der Tumorzellzahlen erfordert die Anzahl von Photonen , die von jeder Tumorzelle emittiert zu wissen , berechnet werden. Außerdem Luciferase – Expression, wie die von vielen Reportergene (z. B. fluoreszierende Proteine) nicht homogen ist , auch in einer Zellpopulation aus einem einzigen Klon abgeleitet 6. Die Zahl der Luciferase-Proteine in Zellen kann nicht genau berechnet werden. Die Etablierung von standardisierten experimentellen Bedingungen scheint somit entscheidend für eine zuverlässige semi-quantitative Analyse.
Wir wendeten die luminoscore Methode auf zwei verschiedene Maus – Lymphom – Modelle 7.8.9. In diesen Modellen sind syngene Tumorzellen in das Auge injiziert oder unter die Haut zu erhalten, die jeweils eine primäre intraokulare Lymphom (PIOL) Modell und ein subkutanes Lymphom (SCL) Modell. In jedem dieser orthotope Modellen wird die Behandlung in situ verabreicht, sieben Tage nach der Tumor – Inokulation für PIOL und wenn der Tumor 0,5 bis 0,7 cm in ihrem größten Durchmesser für SCL erreicht hat.
Wir verwendeten die luminoscore Verfahren die Auswirkungen von di situ CpG – Therapie zu überwachen, vorher wirksamen 7,10,11 erwiesen. CpG ist eine Oligonukleotidsequenz und einem Liganden von TLR9, das wiederum ein intrazellulärer Rezeptor durch zahlreiche ce exprimiertenlls des Immunsystems, einschließlich dendritischen Zellen, B-Lymphozyten, Monozyten und natürlichen Killerzellen. CpG-DNA ist ein 20-mer-DNA-Sequenz, die das CpG (CG) immunstimulatorischen Motiv enthält; die Steuerung (ODN-Kontrolle) ist die gleiche 20-mer DNA-Sequenz, mit der Ausnahme, dass die immunstimulatorischen CG-Sequenz invertiert wird (GC). TLR9 Engagement im Maus – Lymphom wir studieren induziert Apoptose 10, aktiviert das Immunsystem 12 und reduziert dadurch deutlich Tumorbelastung 7,11.
Hier beschreiben wir eine standardisierte Methode zur Quantifizierung von Tumorlast und Ansprechen auf die Behandlung durch Biolumineszenz Bilder. Dieses Verfahren beruht auf verschiedene Aspekte des Bildgebungsverfahrens, von der Erfassung bis zur Analyse, die Zuverlässigkeit zu optimieren, Reproduzierbarkeit, nicht-Benutzerabhängigkeit, und die statistische Signifikanz. Ein Biolumineszenz-Quantifizierungsindex wird jeder Maus zurückgeführt; nicht nur zwischen den Tieren, sondern al kann dieser Wert, der wir eine luminoscore nennen, verglichen werdenso zwischen den Experimenten.
In dieser Arbeit konzentrieren wir uns auf die Biolumineszenz-Bildgebung Verfahren sowie die Bild Quantifizierung durch die luminoscore Methode. Wir zeigen die Wirksamkeit dieser Methode für die Injektions Verifizieren, Überwachung der Tumorbelastung, und die Beurteilung der Wirksamkeit von in situ Behandlung von Krebs. Jeder dieser Punkte wird in repräsentative Ergebnisse aus Experimenten dargestellt mit verschiedenen Mausmodellen die Anpassungsfähigkeit des luminoscore Methode zu markieren.
Die Lichtabsorption von Organen und Geweben bleibt eine Einschränkung der Biolumineszenz-Bildgebung, obwohl diese Einschränkung auf jede optische Bildgebungsverfahren zu eigen ist. Im Rahmen unseres Ansatzes, die Auswirkungen der anatomischen Strukturen auf der luminoscore erwartet geringe Variabilität haben vorgesehen, dass die Studien in einem bestimmten Modell durchgeführt werden (Standort-und-Maus-Strang), so dass dann Vergleiche. Biolumineszenz nicht Anregungslicht benötigen und somit mehr di – vivo – Bildgebung als Fluoreszenz ganzen Körper angepasst.
Die räumliche Auflösung ist auch eine Begrenzung der Biolumineszenz-Bildgebung und genaue Lage des Organs, von dem Biolumineszenz-Photonen emittiert werden, bleibt schwierig. gute Kenntnisse des Modells kann jedoch in der qualitativen Lage der Tumorstellen helfen. Der einzige Ausgang in diesem Biolumineszenz basierende Methode ist die luminoscore. Standort beeinflusst nicht die luminoscore weil die manuelle Aufschlags Region Interest (ROI) deckt die gesamte Maus. Schließlich erfordert Glühwürmchen-Luciferase Sauerstoff. Dementsprechend Biolumineszenz-Bildgebung in der Regel unterschätzt nekrotischen Tumoren. Wiederum eine gute Kenntnis dieser Aspekt des Modells erforderlich ist.
In diesem Papier wollen wir nicht auf die Wirksamkeit von CpG als Anti-Tumor – Medikament Beurteilung (die bereits 7,9,11 nachgewiesen wurde) , aber ein Verfahren , wodurch ein Vergleich der Biolumineszenz Datensätze zu beschreiben. Wir beschreiben in der Tat eine Methode Tumorlast zu quantifizieren helfen soll, für den Vergleich verschiedener Tests an verschiedenen Orten zu unterschiedlichen Zeiten die Akquisitionsprotokoll standardisieren und erfordert keine Computerberechnungen. Um Reproduzierbarkeit und korrekte Photonenfluss Quantifizierung zu gewährleisten, muss die Abbildungsvorrichtung mit einer Licht Referenz für hausgemachte Geräte kalibriert werden oder wie vom Anbieter für kommerzielle Geräte empfohlen.
Unser Protokoll erfordert eine sorgfältige Aufmerksamkeit auf mehrere kritische punkte: (i) Erstens ist die Qualität der Maus Anästhesie entscheidend klare Bilder zu erhalten, insbesondere in Fällen, bei langen Belichtungszeiten. (Ii) Die Quantifizierung Einheit muss immer sein, der Photonenfluss, weil Glanz auf der Oberfläche jeder Maus hängt und könnte für den Vergleich verschiedener Mäuse irrelevant. (Iii) Die Biolumineszenz Bilder müssen nicht gesättigte Pixel enthalten, da diese würde Bias die luminoscore. (iv) Vorder- und Rückseite Erwerb sind verpflichtet , alle Photonen , die von der Tumorstelle emittiert wird, zu sammeln (dh kann vordere Erwerb nicht unbedingt erkennen Photonen von der Rückseite des Tumors). Verschiedene ROI Zeichnungen wurden während der Entwicklung des luminoscore Methode getestet. Nur die manuelle mark-up ergab zufriedenstellende Ergebnisse, die wahrscheinlicher sind statistisch signifikant (Daten nicht gezeigt).
Inoue et al. empfehlen kg eine Luciferin Dosis von 75 mg / 13. Durch die Verwendung einer Dosis von 150 mg / kg statt, den Zeitpunkt der Bildgebung nach demLuciferin Verwaltung bleibt unverändert und wir stellen sicher, dass das Plateau während einer langen Belichtungs Erwerb dauert. Luciferin muss das überschüssige Reaktanden während des Akquisitionsprozesses sein. Je nach Modell kann die Region von Interesse angepasst werden, wie wir in der SCL – Modell zeigte , wo wir zwei ROI pro Tier zog. Im SCL – Modell, die Behandlung injiziert wird , wenn der Tumor 0,5 cm im größten Durchmesser erreicht Variabilität zu begrenzen von Verpflanzung. In Abhängigkeit von den Mäusen, könnte der Tumor unterschiedlich gewachsen. Zur Standardisierung und vergleichen Mäuse, haben wir beschlossen, ein Verhältnis zwischen behandelten und nicht behandelten Seite zu verwenden, um das relative Wachstum beider Flanken Tumoren aufdeckt.
Wenn kein Signal von einer injizierten Maus beobachtet wird erwartet, positiv zu sein, entweder (i) die Anzahl der Zellen ist sehr gering, und das Signal unter der Erfassungsschwelle liegt; oder (ii) fehlt der Maus Sauerstoff und erfordert eine sofortige Versorgung.
Mehrere der quantitative bioluminescrenz Analysen von verschiedenen Autoren erfordern komplexe Berechnungen und Instrumente (zB 3D – Biolumineszenz – Tomographie) zu nähern , die absolute Quantifizierung der emittierten Photonen Biolumineszenz 5,15 beschrieben. Es gibt keinen Konsens über ein Verfahren zur Biolumineszenz reproduzierbar zu quantifizieren, insbesondere in Tumormodellen, mit einem 2D-Imager Biolumineszenz. Unser Ziel war es, die Bildaufnahme-Protokoll zu begrenzen Benutzer-Abhängigkeit zu standardisieren.
Die Injektion von CpG in situ nach der Tumor – Inokulation der Tumorlast in beiden Modellen verringert. Die luminoscore Methode kann als Werkzeug dienen, um die Tumorlast in anderen Modellen von Tumor Immuntherapien überwachen. Tumorlast Überwachung stellt eine nicht-invasive Methode, die unser Verständnis von Tumorwachstum und Metastasierung Mechanismen, ohne sich mit der Tumor-Mikroumgebung zu verbessern. Die Identifizierung der Tiere, die tun und reagieren nicht mit dieser Methode auf die Behandlung wird durch die Überprüfung der s verstärktUccessful Tumorzellinjektion zu Beginn des Experiments.
Wir zeigten hier die Anpassungsfähigkeit des luminoscore Methode in einem SCL Modell A20.IIA-luc2 Zellen. Jedoch kann dieses Verfahren auf andere Tumormodell unter Verwendung von anderen Zelllinien angepasst werden , vorausgesetzt , daß sie die Luciferase oder im Zusammenhang mit T-Zell – Studien (tumorspezifische zytotoxische T-Zellen, regulatorischer T-Zellen, etc.) exprimieren. Die Überwachung von in vivo – Gentransfer im Zusammenhang mit der Gentherapie von seltenen Krankheiten auch die luminoscore Methode durchgeführt werden konnte.
Schließlich zeigen die Daten, dass die Biolumineszenz-basierte luminoscore Verfahren Vergleiche zwischen Experiment ermöglicht, bietet Flexibilität und Anpassungsfähigkeit an spezifische experimentellen Anforderungen und ist ein nützliches Werkzeug für die nichtinvasive Längs präklinischen Studien.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken den Tiereinrichtungen des Cordelier Research Center (CEF, Paris, Frankreich), Genethon (Evry, Frankreich) und Genopole (CERFE, Evry, Frankreich). Wir danken Jo Ann Cahn für ihre sorgfältige Lektüre des Manuskripts. Diese Forschung wurde vom Institut National de la Santé Et de la Rechercher Médicale, Universität Paris Descartes, Pierre & Marie Curie-Universität, der Vereinigung pour la Recherche contre le Cancer unterstützt, die tunesische Direction Générale de la Recherche Scientifique, die französisch-tunesische CMCU Projekt und die Aktionen Thématiques Incitatives de Genopole (ATIGE) Fonds. JC wurde von den Grenzen in der Life-Science-Doktorandenschule und durch ein Stipendium vom INCA (Institut National du Cancer) unterstützt. RBA war ein Empfänger von Zuschüssen aus dem DGRS-INSERM und dem CMCU. SD erhielt einen Zuschuss aus dem Institut National du Cancer.
CpG 1826 | Invivogen | Sequence: 5_-TCCATGACGTTCCTGACGTT Catalog number: tlrl-1826 |
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ODN 1826 control | Invivogen | Sequence: 5_-TCCATGAGCTTCCTGAGCTT Catalog number: tlrl-1826c |
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D-luciferin potassium salt | Interchim | Catalog number: FP-M1224D | |
Ketamin | Virbac, France | ||
Xylazin | Bayer Healthcare | Rompun 2% | |
A20.IIA-luc2 cell line | A20.IIA transfected with pGL4.50[luc2/CMV/hygro]7 (Promega E1310) |
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Mice | Balb/cByj | Six-weeks old females from Charles River | |
IVIS lumina Biolumienscence imager | Perkin Elmer | ||
Living Image software | Perkin Elmer | Used for measuring photon flux on images and drawing ROIs | |
R software (opensource) | R-project | Used for statistic tests | |
Hamilton Precision Serynge 10µL | Hamilton | Product number 7642-01100 | |
Eye ointment | Lacrinorm | ||
Dissecting microscope | ZEISS | Stemi 305 |