Bioluminescence इमेजिंग ट्यूमर और मेटास्टेसिस स्थानीयकृत के लिए एक प्रसिद्ध उपकरण है, लेकिन इन छवियों की मात्रा का ठहराव अक्सर जटिल गणना और विशेष उपकरणों की आवश्यकता है। हम आसान करने के लिए उपयोग luminoscore विधि का वर्णन है, सटीक अधिग्रहण शर्तों के आधार पर, कोई गणना की आवश्यकता होती है, और सक्रिय करने के ट्यूमर बोझ और उपचार की प्रतिक्रिया माउस मॉडल में नजर रखी जा सके।
Although bioluminescence imaging (BLI) shows promise for monitoring tumor burden in animal models of cancer, these analyses remain mostly qualitative. Here we describe a method for bioluminescence imaging to obtain a semi-quantitative analysis of tumor burden and treatment response. This method is based on the calculation of a luminoscore, a value that allows comparisons of two animals from the same or different experiments. Current BLI instruments enable the calculation of this luminoscore, which relies mainly on the acquisition conditions (back and front acquisitions) and the drawing of the region of interest (manual markup around the mouse). Using two previously described mouse lymphoma models based on cell engraftment, we show that the luminoscore method can serve as a noninvasive way to verify successful tumor cell inoculation, monitor tumor burden, and evaluate the effects of in situ cancer treatment (CpG-DNA). Finally, we show that this method suits different experimental designs. We suggest that this method be used for early estimates of treatment response in preclinical small-animal studies.
प्रारंभिक ट्यूमर सेल का पता लगाने के लिए एक चुनौती बनी हुई है और कैंसर के इलाज के प्रभावकारिता को बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण है। विवो में bioluminescence इमेजिंग (BLI) एक बहुत ही संवेदनशील, noninvasive ऑप्टिकल तकनीक, व्यापक रूप से छोटे जानवरों में ट्यूमर की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया जाता है। जुगनू luciferase व्यक्त कोशिकाओं आमतौर पर इस तरह के प्रयोगों 1,2 के लिए उपयोग किया जाता है। इस oxygenase डी luciferin आणविक ऑक्सीजन के साथ ऑक्सीकरण होता लेकिन दो सहकारकों की आवश्यकता है – 2 मिलीग्राम + और adenosine triphosphate 3। जुगनू luciferase renilla luciferase 4 क्योंकि इसके क्वांटम उपज अधिक है की तुलना में vivo इमेजिंग के लिए अधिक उपयुक्त है।
ऑक्सीकरण सब्सट्रेट – oxyluciferin – अनायास अपनी मौलिक राज्य में लौटने के लिए एक फोटान का उत्सर्जन करता है और उसके बाद निष्क्रिय हो जाता है। उत्सर्जित फोटॉनों 530 एनएम के चारों ओर एक अधिकतम तरंग दैर्ध्य है। एक उच्च संवेदनशीलता कैमरा एक छोटे जानवर के अंदर से luminescent फोटॉनों का पता लगाने और छवियों है कि यह poss बनाने प्रदान कर सकते हैंट्यूमर कोशिकाओं का पता लगाने के लिए ible।
फोटोन मायने रखता द्वारा सही ट्यूमर बोझ यों की क्षमता उपचार प्रभावकारिता बढ़ाता के लिए एक शक्तिशाली और संवेदनशील उपकरण के रूप में सेवा कर सकता है। उपचार के प्रभाव जल्दी ही पता लगाया जा सकता है, क्योंकि इस संवेदनशीलता यह सही समय है, जिस पर एक उपचार प्रभावी हो जाता है निर्धारित करने के लिए संभव हो सकता है।
कुल उत्सर्जित फोटॉनों की मात्रा का ठहराव निरपेक्ष बहुत जटिल है। इकट्ठा फोटॉनों की संख्या ट्यूमर की गहराई पर और अंगों फोटॉनों के माध्यम से उत्सर्जित कर रहे हैं पर निर्भर करता है। सुधार पर ऊतक अवशोषण गुणांक के आधार गुणांक गणना की जा सकती 5, लेकिन ट्यूमर सेल नंबर की पूर्ण मात्रा का ठहराव प्रत्येक ट्यूमर सेल द्वारा उत्सर्जित फोटॉनों की संख्या जानने की आवश्यकता है। इसके अलावा, luciferase अभिव्यक्ति, कई रिपोर्टर जीन (जैसे।, फ्लोरोसेंट प्रोटीन) की तरह नहीं सजातीय, एक भी क्लोन 6 से व्युत्पन्न एक सेल की आबादी में है। लूसिफ़ेर की संख्याकोशिकाओं में प्रोटीन एएसई वास्तव में गणना नहीं की जा सकती है। मानकीकृत प्रयोगात्मक शर्तों की स्थापना इस प्रकार एक विश्वसनीय अर्द्ध मात्रात्मक विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण होता है।
हम दो अलग माउस लिंफोमा मॉडल 7,8,9 को luminoscore विधि लागू होता है। इन मॉडलों में, syngeneic ट्यूमर कोशिकाओं आंख में या त्वचा प्राप्त करने के लिए, क्रमशः, एक प्राथमिक intraocular लिम्फोमा (PIOL) मॉडल और एक चमड़े के नीचे लिम्फोमा (एससीएल) मॉडल के तहत इंजेक्शन हैं। इन ओर्थोटोपिक मॉडलों में से प्रत्येक में, उपचार बगल में प्रशासित किया जाता है, सात दिनों PIOL के लिए ट्यूमर टीका के बाद और ट्यूमर एससीएल के लिए अपने सबसे बड़े व्यास में 0.5 से 0.7 सेमी तक पहुँच गया है।
हम luminoscore विधि का इस्तेमाल किया सीटू सीपीजी चिकित्सा में के प्रभाव की निगरानी करने के लिए, पहले से प्रभावी 7,10,11 होना दिखाया। सीपीजी एक oligonucleotide अनुक्रम और TLR9, की एक ligand जो बारी में एक intracellular रिसेप्टर कई सीई द्वारा व्यक्त की हैप्रतिरक्षा प्रणाली के lls, वृक्ष के समान कोशिकाओं बी लिम्फोसाइटों, monocytes, और प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं भी शामिल है। सीपीजी डीएनए एक 20 मेर डीएनए अनुक्रम कि सीपीजी (सीजी) immunostimulatory मूल भाव होता है; नियंत्रण (ODN-नियंत्रण), सिवाय इसके कि immunostimulatory तटरक्षक अनुक्रम उलटा है (जीसी), वही 20-मेर डीएनए अनुक्रम है। Murine लिंफोमा हम अध्ययन कर रहे हैं में TLR9 सगाई apoptosis 10 लाती है, प्रतिरक्षा प्रणाली को सक्रिय करता है 12, और जिससे काफी ट्यूमर बोझ 7,11 कम कर देता है।
यहाँ हम ट्यूमर बोझ और bioluminescent छवियों के माध्यम से उपचार की प्रतिक्रिया बढ़ाता के लिए एक मानकीकृत विधि का वर्णन है। इस विधि के अधिग्रहण से विश्लेषण करने के लिए, इमेजिंग प्रक्रिया के विभिन्न पहलुओं पर निर्भर करता है, विश्वसनीयता, reproducibility, गैर उपयोगकर्ता निर्भरता, और सांख्यिकीय महत्व अनुकूलन करने के लिए। एक bioluminescence मात्रा का ठहराव सूचकांक प्रत्येक माउस के लिए जिम्मेदार ठहराया है; इस मूल्य है, जो हम एक luminoscore फोन, पशुओं, लेकिन अल के बीच न केवल तुलना की जा सकतीप्रयोगों के बीच इतना।
इस काम में, हम bioluminescence इमेजिंग प्रक्रिया के साथ ही luminoscore विधि द्वारा छवि मात्रा का ठहराव पर ध्यान केंद्रित। हम इंजेक्शन की पुष्टि करने, ट्यूमर बोझ निगरानी, और सीटू के कैंसर के इलाज में की प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए इस विधि का प्रभाव दिखा। इन बिंदुओं में से प्रत्येक luminoscore विधि की अनुकूलन क्षमता को उजागर करने के लिए विभिन्न माउस मॉडल का उपयोग कर प्रयोगों से प्रतिनिधि परिणामों में सचित्र है।
अंगों और ऊतकों द्वारा प्रकाश के अवशोषण, bioluminescence इमेजिंग की एक सीमा बनी हुई है, हालांकि इस सीमा के किसी भी ऑप्टिकल इमेजिंग साधन के लिए स्वाभाविक है। हमारे दृष्टिकोण के संदर्भ में, luminoscore पर शारीरिक संरचनाओं के प्रभाव को कम परिवर्तनशीलता प्रदान की है कि पढ़ाई तो तुलना अनुमति देता है, एक दिया मॉडल (स्थान और माउस किनारा) में प्रदर्शन कर रहे है की संभावना है। Bioluminescence उत्तेजना प्रकाश प्रतिदीप्ति से vivo इमेजिंग में पूरे शरीर के लिए अधिक अनुकूलित है की जरूरत है और इस प्रकार नहीं है।
स्थानिक संकल्प भी bioluminescence इमेजिंग की एक सीमा है, और अंग से bioluminescence फोटॉनों उत्सर्जित कर रहे हैं की सटीक स्थान मुश्किल बनी हुई है। हालांकि, मॉडल का अच्छा ज्ञान ट्यूमर साइटों के गुणात्मक स्थान में मदद कर सकते हैं। इस bioluminescence आधारित पद्धति में केवल उत्पादन luminoscore है। स्थान luminoscore को प्रभावित नहीं करता है क्योंकि Interes के मैनुअल मार्क-अप क्षेत्रटी (आरओआई) पूरे माउस को शामिल किया। अंत में, जुगनू luciferase ऑक्सीजन की आवश्यकता है। तदनुसार, bioluminescence इमेजिंग आमतौर पर परिगलित ट्यूमर underestimates। एक बार फिर, मॉडल के इस पहलू का एक अच्छा ज्ञान की आवश्यकता है।
इस पत्र में, हम एक एंटी-ट्यूमर दवा के रूप में सीपीजी की प्रभावकारिता (जो पहले से ही 7,9,11 प्रदर्शन किया गया है), लेकिन एक विधि bioluminescence डेटासेट की तुलना की अनुमति का वर्णन करने के आकलन पर निशाना नहीं कर रहे हैं। हम वास्तव में ट्यूमर बोझ अलग अलग समय पर अलग-अलग स्थानों में अलग अलग assays की तुलना के लिए अधिग्रहण प्रोटोकॉल का मानकीकरण करने में मदद करने के उद्देश्य से यों के लिए एक विधि का वर्णन है और है कि कंप्यूटर गणना की आवश्यकता नहीं है। reproducibility और सही फोटॉन प्रवाह मात्रा का ठहराव सुनिश्चित करने के लिए, इमेजिंग डिवाइस घर में बने उपकरणों के लिए एक प्रकाश संदर्भ के साथ calibrated किया जाना चाहिए या के रूप में वाणिज्यिक उपकरणों के लिए प्रदाता द्वारा की सिफारिश की।
हमारी प्रोटोकॉल कई महत्वपूर्ण पी करने के लिए सावधान ध्यान देने की आवश्यकताoints: (i) पहले, माउस संज्ञाहरण की गुणवत्ता, स्पष्ट चित्र प्राप्त करने के लिए विशेष रूप से लंबे समय जोखिम समय के साथ मामलों में के लिए महत्वपूर्ण है। (Ii) मात्रा का ठहराव इकाई हमेशा होना चाहिए फोटॉन प्रवाह हो सकता है क्योंकि चमक प्रत्येक माउस की सतह क्षेत्र पर निर्भर करता है और अलग चूहों की तुलना के लिए अप्रासंगिक हो सकता है। (Iii) bioluminescence छवियों, संतृप्त पिक्सल शामिल नहीं करना चाहिए, क्योंकि इन पूर्वाग्रह luminoscore होगा। (iv) पीठ और सामने अधिग्रहण सभी फोटॉनों ट्यूमर साइट (यानी, सामने अधिग्रहण जरूरी ट्यूमर के पीछे से फोटॉनों का पता नहीं लगा सकते हैं) से उत्सर्जित इकट्ठा करने के लिए आवश्यक हैं। विभिन्न विभिन्न रॉय चित्र luminoscore विधि के विकास के दौरान परीक्षण किया गया। केवल मैनुअल मार्क-अप संतोषजनक परिणाम है कि अधिक सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण हो सकता है (नहीं दिखाया डेटा) की संभावना है झुकेंगे।
Inoue एट अल। 75 मिलीग्राम की एक खुराक की सिफारिश luciferin / किलो 13। 150 मिलीग्राम की एक खुराक का उपयोग करके / के बाद के बजाय किलो, इमेजिंग के समयluciferin प्रशासन अपरिवर्तित रहता है और हम यह सुनिश्चित करना है कि पठार एक लंबे समय जोखिम अधिग्रहण भर रहता है। Luciferin अधिग्रहण की प्रक्रिया के दौरान अतिरिक्त अभिकारक होना चाहिए। मॉडल पर निर्भर करता है, ब्याज के क्षेत्र, अनुकूलित किया जा सकता है, क्योंकि हम एससीएल मॉडल जहां हम जानवरों के प्रति दो रॉय आकर्षित में पता चला है। एससीएल मॉडल में, उपचार इंजेक्ट किया जाता है जब ट्यूमर अपने सबसे बड़े व्यास परिवर्तनशीलता सीमित करने में 0.5 सेमी तक पहुँचता है engraftment की। चूहों पर निर्भर करता है, ट्यूमर अलग ढंग से बड़े हो गए हो सकता है। मानकीकरण और चूहों की तुलना करने के लिए, हम इलाज और गैर इलाज पक्ष के बीच एक अनुपात है कि दोनों किनारों ट्यूमर के सापेक्ष विकास का पता चलता है का उपयोग करने का फैसला किया है।
कोई संकेत, सकारात्मक होने की उम्मीद कर एक इंजेक्शन माउस से मनाया जाता है या तो (i) कोशिकाओं की संख्या बहुत कम है और संकेत का पता लगाने सीमा से नीचे है; या (ii) माउस ऑक्सीजन का अभाव है और तत्काल देखभाल की आवश्यकता है।
मात्रात्मक bioluminesc के अनेकखिलाडि़यों विभिन्न लेखकों द्वारा वर्णित विश्लेषण उत्सर्जित bioluminescence फोटॉनों 5,15 के पूर्ण मात्रा का ठहराव दृष्टिकोण करने के लिए जटिल गणना और उपकरणों (जैसे, 3 डी bioluminescence टोमोग्राफी) की आवश्यकता होती है। वहाँ reproducibly bioluminescence बढ़ाता है, विशेष रूप से ट्यूमर मॉडल में, एक 2 डी bioluminescence इमेजर के साथ के लिए एक विधि पर कोई आम सहमति नहीं है। हमारा उद्देश्य उपयोगकर्ता निर्भरता को सीमित करने की छवि अधिग्रहण प्रोटोकॉल का मानकीकरण करने के लिए था।
ट्यूमर टीका के बाद बगल में सीपीजी के इंजेक्शन दोनों मॉडल में ट्यूमर बोझ कम हो। luminoscore विधि ट्यूमर immunotherapies के अन्य मॉडलों में ट्यूमर बोझ की निगरानी के लिए एक उपकरण के रूप में सेवा कर सकते हैं। निगरानी ट्यूमर बोझ एक noninvasive तरीका है कि ट्यूमर microenvironment के साथ हस्तक्षेप किए बिना ट्यूमर के विकास और मेटास्टेसाइज़िंग तंत्र के बारे में हमारी समझ में सुधार कर सकते हैं प्रदान करता है। जानवरों है कि क्या करना है और इस विधि के साथ उपचार का जवाब नहीं है की पहचान एस के सत्यापन से मजबूत बनाया हैप्रयोग की शुरुआत में uccessful ट्यूमर सेल इंजेक्शन।
हम यहाँ A20.IIA-luc2 कोशिकाओं का उपयोग कर एक एससीएल मॉडल में luminoscore विधि की अनुकूलनशीलता दिखाया। हालांकि, इस पद्धति अन्य सेल लाइनों बशर्ते कि वे luciferase व्यक्त करते हैं, या का उपयोग कर किसी अन्य ट्यूमर मॉडल के लिए अनुकूलित किया जा सकता टी सेल स्टडीज (ट्यूमर विशिष्ट साइटोटोक्सिक टी कोशिकाओं, विनियामक टी कोशिकाओं, आदि) के संदर्भ में। दुर्लभ बीमारी के जीन थेरेपी के संदर्भ में इन विवो जीन स्थानांतरण की निगरानी भी luminoscore विधि का उपयोग किया जा सकता है।
अंत में आंकड़ों से पता चलता है कि bioluminescence आधारित luminoscore विधि प्रयोगों के बीच तुलना में सक्षम बनाता है, विशिष्ट प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के लचीलापन और अनुकूलन क्षमता प्रदान करता है, और noninvasive अनुदैर्ध्य preclinical अध्ययन के लिए एक उपयोगी उपकरण है।
The authors have nothing to disclose.
हम Cordelier रिसर्च सेंटर (CEF, पेरिस, फ्रांस), Genethon (Evry, फ्रांस) और Genopole (CERFE, Evry, फ्रांस) के पशु सुविधाओं धन्यवाद। हम पांडुलिपि की उसे सावधान पढ़ने के लिए जो एन Cahn धन्यवाद। इस शोध संस्थान में राष्ट्रीय डी ला Santé एट डी ला Rechercher médicale, पेरिस डेसकार्टेस विश्वविद्यालय, पियरे और मैरी क्यूरी विश्वविद्यालय, एसोसिएशन डालना ला Recherche contre le कर्क, ट्यूनीशियाई दिशा जेनरल डे ला Recherche Scientifique, फ्रेंको-ट्यूनीशियाई CMCU द्वारा समर्थित किया गया परियोजना, और Thématiques Incitatives डी Genopole (ATIGE) धन प्रक्रिया। जे.सी. जीवन विज्ञान में डॉक्टरेट स्कूल में फ्रंटियर्स द्वारा और इंका (Institut राष्ट्रीय du कैंसर) से एक फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया। RBA DGRS-INSERM और CMCU से अनुदान के एक प्राप्तकर्ता था। एसडी इंस्टीट्यूट राष्ट्रीय du कैंसर से अनुदान प्राप्त किया।
CpG 1826 | Invivogen | Sequence: 5_-TCCATGACGTTCCTGACGTT Catalog number: tlrl-1826 |
|
ODN 1826 control | Invivogen | Sequence: 5_-TCCATGAGCTTCCTGAGCTT Catalog number: tlrl-1826c |
|
D-luciferin potassium salt | Interchim | Catalog number: FP-M1224D | |
Ketamin | Virbac, France | ||
Xylazin | Bayer Healthcare | Rompun 2% | |
A20.IIA-luc2 cell line | A20.IIA transfected with pGL4.50[luc2/CMV/hygro]7 (Promega E1310) |
||
Mice | Balb/cByj | Six-weeks old females from Charles River | |
IVIS lumina Biolumienscence imager | Perkin Elmer | ||
Living Image software | Perkin Elmer | Used for measuring photon flux on images and drawing ROIs | |
R software (opensource) | R-project | Used for statistic tests | |
Hamilton Precision Serynge 10µL | Hamilton | Product number 7642-01100 | |
Eye ointment | Lacrinorm | ||
Dissecting microscope | ZEISS | Stemi 305 |