Bioluminesens bildebehandling er et velkjent verktøy for lokalisering av svulster og metastaser, men kvantifisering av disse bildene krever ofte komplekse beregninger og spesielle instrumenter. Vi beskriver lett-å-bruke luminoscore metode, basert på presise oppkjøps forhold, krever ingen beregninger, og muliggjør tumorbelastning og behandlingsrespons som skal overvåkes i musemodeller.
Although bioluminescence imaging (BLI) shows promise for monitoring tumor burden in animal models of cancer, these analyses remain mostly qualitative. Here we describe a method for bioluminescence imaging to obtain a semi-quantitative analysis of tumor burden and treatment response. This method is based on the calculation of a luminoscore, a value that allows comparisons of two animals from the same or different experiments. Current BLI instruments enable the calculation of this luminoscore, which relies mainly on the acquisition conditions (back and front acquisitions) and the drawing of the region of interest (manual markup around the mouse). Using two previously described mouse lymphoma models based on cell engraftment, we show that the luminoscore method can serve as a noninvasive way to verify successful tumor cell inoculation, monitor tumor burden, and evaluate the effects of in situ cancer treatment (CpG-DNA). Finally, we show that this method suits different experimental designs. We suggest that this method be used for early estimates of treatment response in preclinical small-animal studies.
Tidlig svulst celle påvisning er fortsatt en utfordring og er avgjørende for å øke kreftbehandling effekt. In vivo bioluminesens imaging (BLI) er en svært følsom, ikke-invasiv optisk teknikk, mye brukt for å overvåke svulster i små dyr. Ildflueluciferase-uttrykkende celler blir ofte brukt for slike eksperimenter 1,2. Dette oxygenase oksiderer D-luciferin med molekylært oksygen, men krever to kofaktorer – Mg 2+ og adenosin trifosfat tre. Ildflue luciferase er mer egnet for in vivo avbildning enn Renilla luciferase 4 fordi dens kvanteutbytte er høyere.
Den oksidert underlaget – oxyluciferin – spontant avgir et foton å gå tilbake til sin grunnleggende tilstand og deretter blir inaktiv. De utsendte fotoner ha en maksimal bølgelengde rundt 530 nm. En høy følsomhet kamera kan detektere den luminescerende fotonene fra innsiden av et lite dyr, og gi bilder som gjør det Muligible for å lokalisere tumorceller.
Muligheten til å kvantifisere tumorbyrde nøyaktig ved fotontelling kan tjene som en kraftig og følsomt verktøy for kvantifisering av behandlingseffekten. Fordi behandlingseffekter kan detekteres før, kan denne følsomhet gjør det mulig å bestemme det nøyaktige øyeblikk hvor en behandling blir effektiv.
Absolutt mengdebestemmelse av det totale utsendte fotoner er meget kompleks. Antallet av fotoner som er samlet avhenger av dybden av tumoren og på organer fotonene slippes gjennom. Korreksjonskoeffisienter basert på vev absorpsjonskoeffisienter kan beregnes 5, men den absolutte kvantifisering av tumorcelleantall krever kjenne antallet av fotoner som sendes ut av hver tumor celle. Videre er luciferase uttrykk, som det av flere rapportørgener (f.eks., Fluorescerende proteiner) ikke homogent, til og med i en cellepopulasjon avledet fra en enkelt klon 6. Antallet luciferASE proteiner i celler kan ikke beregnes nøyaktig. Etableringen av standardiserte forsøksbetingelser vises derfor avgjørende for en pålitelig semi-kvantitativ analyse.
Vi benyttet den luminoscore metoden til to forskjellige muslymfomceller modeller 7,8,9. I disse modellene er syngeniske tumorceller injisert i øyet eller under huden for å oppnå henholdsvis en primær intraokulær lymfom (Piol) modell og en subkutan lymfom (SCL) modell. I hver av disse modellene ortotopiske, blir behandlingen administreres in situ, syv dager etter svulst inokulering for Piol og når tumoren har nådd 0,5 til 0,7 cm i dets største diameter for SCL.
Vi brukte luminoscore metode for å overvåke effekten av di situ CpG terapi, tidligere vist å være effektive 7,10,11. CpG er en oligonukleotid-sekvens og en ligand av TLR9, som i sin tur er en intracellulær reseptor uttrykt ved tallrike cells av immunsystemet, inkludert dendrittiske celler, B-lymfocytter, monocytter og naturlige dreperceller. CpG-DNA er en 20-mer DNA-sekvens som inneholder CpG (CG) immunstimulerende motiv; kontrollen (ODN-kontroll), er den samme 20-mer-DNA-sekvensen, bortsett fra at det immunstimulerende CG sekvensen er invertert (GC). TLR9 engasjement i murine lymfom vi studerer induserer apoptose 10, aktiverer immunsystemet 12, og dermed reduserer tumorbelastning 7,11 betydelig.
Her beskriver vi en standardisert metode for å kvantifisere tumorbelastning og behandlingsrespons gjennom selvlysende bilder. Denne metoden er avhengig av ulike aspekter av bilde prosedyren, fra anskaffelse til analyse, for å optimalisere pålitelighet, reproduserbarhet, non-user avhengighet, og statistisk signifikans. En bioluminesens kvantifisering indeksen er knyttet til hver mus; denne verdien, som vi kaller en luminoscore, kan sammenlignes ikke bare mellom dyr, men alså mellom eksperimenter.
I dette arbeidet har vi fokus på bioluminescence bildebehandling prosedyre samt bilde kvantifisering av luminoscore metoden. Vi viser effektiviteten av denne fremgangsmåte for å verifisere injeksjon, overvåking tumorbyrde, og vurdering av effektiviteten av in situ behandling av kreft. Hvert av disse punktene er illustrert i representative resultater fra forsøk med ulike musemodeller for å markere tilpasningsevne av luminoscore metoden.
Lys absorpsjon av organer og vev er fortsatt en begrensning av bioluminesens imaging, selv om denne begrensningen er iboende i ethvert optisk avbildningsfunksjonalitet. I sammenheng med vår tilnærming, blir virkningene av anatomiske strukturer på luminoscore forventet å ha lav variasjon forutsatt at undersøkelsene er utført i en gitt modell (plassering og mus streng), slik at deretter sammenligninger. Bioluminesens trenger ikke eksitasjonslys og således er mer tilpasset til hele kroppen in vivo avbildning enn fluorescens.
Romlig oppløsning er også en begrensning av bioluminesens imaging, og nøyaktig plassering av orgelet som Bioluminescens fotoner sendes ut er fortsatt vanskelig. Imidlertid kan gode kunnskaper om modellen hjelpe i den kvalitative plassering av tumorsteder. Den eneste utgang i dette bioluminescence baserte metoden er den luminoscore. Plassering påvirker ikke luminoscore fordi den manuelle påslag Region of interest (ROI) dekker hele musen. Til slutt krever ildflue luciferase oksygen. Følgelig bioluminesens bildeundervurderer vanligvis nekrotiske svulster. Igjen, er en god kjennskap til dette aspektet av den modell som kreves.
I denne artikkelen, er vi ikke sikte på å vurdere effekten av CpG som et anti-tumor medikament (som allerede har blitt demonstrert 7,9,11), men for å beskrive en fremgangsmåte som tillater sammenligning av Bioluminescens datasett. Vi faktisk beskriver en metode for å kvantifisere tumorbyrden skal bidra til å standardisere oppkjøpet protokollen for å sammenligne ulike analyser på forskjellige steder til forskjellige tider, og som ikke krever databeregninger. For å sikre reproduserbarhet og riktig foton flux kvantifisering, må bildeenheten kalibreres med en lett referanse for hjemmelaget enheter eller som anbefalt av leverandøren for kommersielle enheter.
Vår protokollen krever nøye oppmerksomhet til flere kritiske points: (i) Først er avgjørende for å oppnå klare bilder, spesielt i tilfeller med lange eksponeringstider kvaliteten på mus anestesi. (Ii) Kvantifiseringen Enheten må være alltid være foton fluksen fordi utstråling er avhengig av overflatearealet til hver mus og kan være irrelevant for å sammenligne ulike mus. (Iii) bioluminescence Bildene må ikke inneholde mettede piksler, fordi disse ville skjevhet luminoscore. (iv) foran og bak oppkjøpet er pålagt å samle alle fotoner som sendes ut fra svulsten området (dvs. kan fram oppkjøpet ikke nødvendigvis oppdager fotoner fra baksiden av svulsten). Ulike ROI tegninger ble testet under utviklingen av den luminoscore metoden. Bare den manuelle påslag gitt tilfredsstillende resultater som er mer sannsynlig å være statistisk signifikant (data ikke vist).
Inoue et al. anbefaler en luciferin dose på 75 mg / kg 13. Ved å bruke en dose på 150 mg / kg i stedet, tidspunktet for avbildning etterluciferin administrasjon forblir uendret og vi sørger for at platået varer gjennom en lang eksponering oppkjøpet. Luciferin må være det overskytende reaktant gjennom hele anskaffelsesprosessen. Avhengig av modell, kan regionen av interesse tilpasses, slik vi viste i SCL modell der vi trakk to ROI per dyr. I SCL-modell, er behandlingen injiseres når svulsten når 0,5 cm i sin største diameter for å begrense variabiliteten av engraftment. Avhengig av mus, kan tumoren vokst på en annen måte. For å standardisere og sammenligne mus, bestemte vi oss for å bruke et forhold mellom behandlet og ubehandlet side som viser den relative veksten av begge flanker svulster.
Dersom ikke noe signal observeres fra et injisert mus forventet å være positiv, enten (i) antall celler som er meget lavt og signalet er under deteksjonsgrensen; eller (ii) mus mangler oksygen og krever umiddelbar behandling.
Flere av de kvantitative biolumineschet analyser beskrevet av ulike forfattere krever komplekse beregninger og instrumenter (for eksempel 3D bioluminesens tomografi) å nærme seg den absolutte kvantifisering av slippes Bioluminescens fotoner 5,15. Det er ingen enighet om en metode for å kvantifisere bioluminescence reproduserbart, spesielt i tumormodeller, med en 2D bioluminesens imager. Vårt mål var å standardisere bildet oppkjøpet protokollen for å begrense bruker avhengighet.
Injeksjon av CpG in situ etter tumorinokulasjon redusert tumorbyrde i begge modellene. Den luminoscore metoden kan fungere som et verktøy for å overvåke tumorbyrde i andre modeller av tumorimmunterapi. Overvåking tumorbelastning gir en ikke-invasiv metode som kan øke vår forståelse av tumorvekst og metastasering mekanismer uten å forstyrre svulsten mikromiljøet. Identifiseringen av dyr som ikke gjør det responderer på behandling med denne metode er forsterket ved verifisering av sVellykket tumorcelle-injeksjon ved begynnelsen av forsøket.
Vi her viste omstillingsevnen i luminoscore metoden i en SCL modellen ved hjelp A20.IIA-luc2 celler. Imidlertid kan denne fremgangsmåte tilpasses til en hvilken som helst annen tumormodell ved å bruke andre cellelinjer, forutsatt at de uttrykker luciferase, eller i sammenheng med T-cellestudier (tumorspesifikke cytotoksiske T-celler, regulatoriske T-celler, etc.). Overvåkingen av in vivo genoverføring i sammenheng med genterapi av sjeldne sykdom kan også gjøres ved hjelp av luminoscore metode.
Endelig data viser at bioluminescence baserte luminoscore metoden gjør sammenligninger mellom eksperimenter, og tilbyr fleksibilitet og tilpasningsevne til bestemte eksperimentelle behov, og er et nyttig verktøy for ikke-invasiv longitudinelle prekliniske studier.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker dyr fasilitetene på Cordelier Research Center (CEF, Paris, Frankrike), Genethon (Evry, Frankrike) og Genopole (CERFE, Evry, Frankrike). Vi takker Jo Ann Cahn for henne forsiktig lesing av manuskriptet. Denne forskningen ble støttet av Institut National de la Santé et de la rechercher MEDICALE, Paris Descartes University, Pierre & Marie Curie University, Foreningen pour la Recherche contre le Cancer, den tunisiske Direction Générale de la Recherche Scientifique, den fransk-tunisiske CMCU prosjekt, og Handlinger Thématiques Incitatives de Genopole (ATIGE) midler. JC ble støttet av de Frontiers i Life Science doktor skolen og med et fellesskap fra INCA (Institut National du Cancer). RBA var en mottaker av tilskudd fra dgrs-INSERM og CMCU. SD fikk et stipend fra Institut National du Cancer.
CpG 1826 | Invivogen | Sequence: 5_-TCCATGACGTTCCTGACGTT Catalog number: tlrl-1826 |
|
ODN 1826 control | Invivogen | Sequence: 5_-TCCATGAGCTTCCTGAGCTT Catalog number: tlrl-1826c |
|
D-luciferin potassium salt | Interchim | Catalog number: FP-M1224D | |
Ketamin | Virbac, France | ||
Xylazin | Bayer Healthcare | Rompun 2% | |
A20.IIA-luc2 cell line | A20.IIA transfected with pGL4.50[luc2/CMV/hygro]7 (Promega E1310) |
||
Mice | Balb/cByj | Six-weeks old females from Charles River | |
IVIS lumina Biolumienscence imager | Perkin Elmer | ||
Living Image software | Perkin Elmer | Used for measuring photon flux on images and drawing ROIs | |
R software (opensource) | R-project | Used for statistic tests | |
Hamilton Precision Serynge 10µL | Hamilton | Product number 7642-01100 | |
Eye ointment | Lacrinorm | ||
Dissecting microscope | ZEISS | Stemi 305 |