Bioluminescence baserad tumör Kvantifiering Metod för övervakning tumörprogression och behandlingseffekter i mus Lymfom modeller

Summary

Mareld avbildning är ett välkänt verktyg för att lokalisera tumörer och metastaser, men kvantifiering av dessa bilder kräver ofta komplexa beräkningar och särskilda instrument. Vi beskriver lättanvända luminoscore metod, baserad på exakta förvärvsvillkor, kräver inga beräkningar, och gör det möjligt för tumörbörda och behandlingsrespons övervakas i musmodeller.

Abstract

Although bioluminescence imaging (BLI) shows promise for monitoring tumor burden in animal models of cancer, these analyses remain mostly qualitative. Here we describe a method for bioluminescence imaging to obtain a semi-quantitative analysis of tumor burden and treatment response. This method is based on the calculation of a luminoscore, a value that allows comparisons of two animals from the same or different experiments. Current BLI instruments enable the calculation of this luminoscore, which relies mainly on the acquisition conditions (back and front acquisitions) and the drawing of the region of interest (manual markup around the mouse). Using two previously described mouse lymphoma models based on cell engraftment, we show that the luminoscore method can serve as a noninvasive way to verify successful tumor cell inoculation, monitor tumor burden, and evaluate the effects of in situ cancer treatment (CpG-DNA). Finally, we show that this method suits different experimental designs. We suggest that this method be used for early estimates of treatment response in preclinical small-animal studies.

Introduction

Tidig tumörcell upptäckt fortfarande en utmaning och är avgörande för att förbättra cancerbehandling effekt. In vivo mareld imaging (BLI) är en mycket känslig, icke-invasiv optisk teknik, ofta används för att övervaka tumörer hos små djur. Eldflugeluciferas-uttryckande celler används vanligen för sådana experiment ^1,2. Detta oxygenas oxiderar D-luciferin med molekylärt syre men kräver två kofaktorer – Mg ²⁺ och adenosintrifosfat ^tre. Eldfluga luciferas är mer lämplig för in vivo-avbildning än Renilla luciferas ⁴ eftersom dess kvantutbyte är högre.

Den oxiderade substratet – oxyluciferin – avger spontant en foton att återgå till sitt grundtillstånd och sedan blir inaktiv. De emitterade fotonerna har en maximal våglängd runt 530 nm. En högkänslig Kameran kan upptäcka de luminiscerande fotoner från insidan av ett litet djur och ger bilder som gör det möjlible att lokalisera tumörceller.

Förmågan att kvantifiera tumörbörda noggrant genom fotonräkningar skulle kunna fungera som ett kraftfullt och känsligt verktyg för att kvantifiera behandlingseffekt. Eftersom behandlingseffekter kan upptäckas tidigare, kan denna känslighet gör det möjligt att fastställa den exakta tidpunkt då en behandling blir effektiv.

Absolut kvantifiering av den totala emitterade fotonerna är mycket komplex. Antalet fotoner samlats beror på djupet av tumören och på organ fotonerna som släpps ut genom. Korrigeringskoefficienter baserade på vävnads absorptionskoefficienter kan beräknas ^5, men absolut kvantifiering av tumörcellantal kräver känna till antalet fotoner som emitteras av varje tumörcell. Dessutom är inte homogen luciferasuttryck, i likhet med många reportergener (t ex., Fluorescerande proteiner), även i en cellpopulation härledd från en enda klon ^6. Antalet luciferASE proteiner i celler kan inte beräknas exakt. Fastställandet av standardiserade experimentella betingelser förefaller således avgörande för en tillförlitlig halv kvantitativ analys.

Vi tillämpade luminoscore metod för att två olika mus lymfom modeller ^7,8,9. I dessa modeller är syngena tumörceller injiceras i ögat eller under huden för att erhålla respektive en primär intraokulära lymfom (PIOL) modell och en subkutan lymfom (SCL) modell. I vart och ett av dessa orthotopic modeller, är behandlingen administreras på plats, sju dagar efter tumörinokulering för PIOL och när tumören har nått 0,5 till 0,7 cm i sin största diameter för SCL.

Vi använde luminoscore metod för att övervaka effekterna av di situ CpG terapi, som tidigare visat sig vara effektiv ^7,10,11. CpG är en oligonukleotidsekvens och en ligand av TLR9, som i sin tur är en intracellulär receptor som uttrycks av många cells i immunsystemet, inklusive dendritiska celler, B-lymfocyter, monocyter och naturliga mördarceller. CpG-DNA är en 20-mer DNA-sekvens som innehåller CpG (CG) immunstimulerande motiv; kontrollen (ODN-kontroll) är samma 20-mer-DNA-sekvens, med undantag av att den immunstimulerande CG-sekvensen är inverterad (GC). TLR9 engagemang i murina lymfom vi studerar inducerar apoptos ^10, aktiverar immunförsvaret ^12, och därmed avsevärt minskar tumörbörda ^7,11.

Här beskriver vi en standardiserad metod för att kvantifiera tumörbörda och behandlingssvar genom självlysande bilder. Denna metod förlitar sig på olika aspekter av avbildningsproceduren, från förvärv till analys, för att optimera tillförlitlighet, reproducerbarhet, icke-användare beroende, och statistisk signifikans. En mareld kvantifiering index tillskrivs varje mus; Detta värde, som vi kallar en luminoscore, kan jämföras inte bara mellan djur men alså mellan experiment.

I detta arbete fokuserar vi på mareld avbildning förfarande samt bild kvantifiering av luminoscore metoden. Vi visar hur effektiv denna metod för att kontrollera injektion, övervakning tumörbörda, och bedöma effekten av in situ cancerbehandling. Var och en av dessa punkter visas i representativa resultat från experiment med användning av olika musmodeller för att markera den anpassningsförmåga luminoscore metoden.

Protocol

Alla förfaranden som involverar möss följs EU: s riktlinjer, franska regler för djurförsök (Jord- lag nr 2001-464, maj 2001), och riktlinjerna från Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) utskottet Animal Research, och har godkänts av den berörda lokala utskott (Charles Darwin etikkommittén för djurförsök, Paris, Frankrike, Tillståndsnummer: p3 / 2009/004). 1. Cellberedning Växa mus B-lymfom-cellinje A20.IIA-luc2 i RPMI-1640 Glutamax medium kompletterat med 10% fetalt kalvserum, 100 | ig / ml penicillin, 100 | ig / ml streptomycin, 10 mM natriumpyruvat, 50 ^ M 2-merkaptoetanol och 0,50 mg / ml hygromycin B. Bibehålla cellkultur vid 37 ° C, 5% CO2 och ändra medium var två till tre dagar. Harvest 5 ml av cellsuspensionen med en pipett en dag efter att ha bytt mediet. Spin-celler vid 3005; g under 10 min och suspendera cellerna i 3 ml steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Upprepa detta steg två gånger för att tvätta cellerna. Blanda 15 l cellsuspension med 30 ^ trypanblått märkning innan du lägger en Malassez räknekammare. Beräkna cellkoncentrationen med formeln: Koncentration (celler / ml) = Antal celler i räkningen nätet * 3 * 1000. Snurra cellerna en mer tid vid 300 xg under 10 min. Avlägsna supernatanten med en pipett. Med C den koncentration som beräknats vid steg 1,4), antalet celler är N = C * 3. Beräkna volymen av steril PBS 1x krävs för att erhålla cellsuspension A vid en koncentration av 5 x 10 7 celler / ml med följande formel: PBS Volym (ml) = N / (5 x 10 7). Suspendera cellpelleten (från steg 1,5)) i volymen av steril PBS 1x beräknat i föregående mening. Cellsuspension A skall användas i SCL modell (in vivo injicerade volymen är 100 | il: 5 x 10 6-cells). Pipett 10 ul av cellsuspensionen A och lägga 90 l sterilt PBS i en 1,5 ml rör för att erhålla 100 pl cellsuspension B på 5 x 10 6 celler per ml. Cellsuspension B skall användas i PIOL modell (in vivo injicerade volymen är 2 | j, l: 1 x 10 4 celler). 2. Luciferin Späd 1 g av D-luciferin kaliumsalt pulver i 30 ml steril PBS 1x i en 50-ml rör och skaka i några sekunder för att upplösa aggregaten. OBS: Eftersom luciferin är ljuskänslig, förbereda 500 l alikvoter i mörka 1,5 ml mikrocentrifugrör. Förvara alikvoter vid -20 ° C. OBS: De alikvoter kan lagras under flera månader. Efter upptining skall alikvoterna inte lagras i mer än 1 dag vid + 4 ° C. Frysning-upptiningscykler är att föredra framför lagring vid 4 ° C. Injicera 100 pl D-luciferin kaliumsalt lösning intraperitonealt för varje bild assay. OBS: Denna lösning motsvarar 3,3 mg per mus för en dos av 150 mg / kg. 3. anestetikblandning och Anesthetization Förbereda ett bedövningsmedel lösning genom blandning av ketamin 120 mg / kg och xylazin 6 mg / kg i steril PBS 1x. Injicera 60 pl anestesiblandningar intraperitonealt för varje bildanalysen med en 25 G-nål. För kirurgi (med PIOL eller SCL modell), injicera 80 | il av blandningen för att erhålla en djupare bedövning. Sätt musen tillbaka i sin bur. När musen visas orörlig, ta bort den från sin bur och försiktigt pressa musens ben mellan fingrarna. Om musen reagerar med en flykt reflex, vänta flera minuter. Upprepa åtgärden tills musen inte reagerar, vilket bekräftar tillfredsställande bedövning. Placera musen på en värmeplatta eller under en värmande ljus. Applicera ögonsalva att undvika ögon torrhet under anesthetization för bildanalysen eller SCL kirurgi. appliceraögonsalva efter operation för PIOL modellen. 4. Kirurgi och cellympning OBS: Utför alla kirurgiska ingrepp på en värmeplatta eller under en värmande ljus, i en typ en mikrobiologisk säkerhetsbänk i ett djur skyddsnivå 2 anläggning. Alla kirurgiska verktyg som används i detta avsnitt autoklaverades före användning. Subkutan lymfom Modell: Bereda 100 pl av cellsuspensionen erhållen i steg 1,6 i en 1-ml spruta med en 25 G-nål. Försiktigt pressa mushuden på flanken mellan fingrarna, vid injektionsstället. Stick in nålen exakt i hudveck. För att säkerställa subkutan injektion, inte placera nålen djupt in i vävnaden. Injicera cellerna in i skinfold. Observera om lite flytande boll visas under huden för att bekräfta att injektionen utfördes korrekt. PIOL modell: OBS: Detta förfarandet kräver 2 operatörer, som avses här som operatör en och operatör 2. Borttagning av bindhinnan: Operatörs en plats musen under ett dissektionsmikroskop. Tryck försiktigt med fingrarna på vardera sidan av ögat för att rensa den. Behålla denna position. Operatörs 2 l ook genom dissektionsmikroskop. Ta tag i bindhinnan med en liten tång i ena handen; med den andra handen, skär den konjunktiva strax under tången med en liten par av kirurgiska saxar. Operatörs ett frigör öga musknappen vid steg 4.2.1.1) Cellinjektion: Förbered en 10-il trubbig precision spruta. Tvätta genom att pumpa sterilt avjoniserat vatten genom det. Upprepa två gånger eller tre gånger för att se till att det inte finns några bubblor i sprutan. förbereda sedan 2 pl cellsuspension för injektion. Operatörs två tryck försiktigt med fingrarna på dene handen på varje sida av ögat för att klara det. Behålla denna position. Operatörs ett grepp kanten av ögat med en liten tång i ena handen och dra det försiktigt bakåt för att sträcka vävnaden. Operatörs 2 l ook genom dissektionsmikroskop. Med den andra handen, gör ett litet hål i den nedre ögongloben av musen med en 32 G nål. Operatörs 2 lägga ner nålen och plocka upp (med samma hand) precisionen sprutan och för in nålen i hålet vid steg 4.2.2.4. Operatörs ett tryck på sprutans kolv med den andra handen. Har Operator 2 K ONTROLLERA med dissektionsmikroskop att cellsuspensionen i sprutan har injiceras korrekt inne i ögongloben (vätskeflödet är lätt att observera). Operatörs 2 r EFlytta precisionen sprutan. Operatörs en r elease kanten av enimal ögat greppas vid steg 4.2.2.3) Har Operator 2 r elease sidorna av ögat som pressats vid steg 4.2.2.2) Applicera ögonsalva omedelbart. OBS: Om alla steg utfördes korrekt, bör musen inte blöder alls under denna procedur. 5. Bioluminescence Imaging – Dag 0 OBS: Alla produkter injiceras i musen måste vara vid RT före injektion. Efter tumörceller har ympats, och medan djuret fortfarande sövda, gå vidare till stegen för avbildning. Slå på Imager och öppna förvärv programvara. Initiera kamerans, stegen, och linserna genom att klicka på "Initiera" -knappen. Initieringen kommer att ta 10 till 15 minuter för att vara fullständig. Injicera 100 ul av D-luciferin kaliumsaltlösning intraperitonealt med en 25 G-nål. Inte administrera den intravenöst. Om intravenouadministration krävs av någon anledning, måste D-luciferin natriumsalt användas i stället för D-luciferin kaliumsalt. OBS: Luciferin är överskottet reaktant vid denna koncentration; därför bioluminescens signalen når en platå efter 3-7 min och kvarstår i mer än 30 min. 10 minuter efter D-luciferin injektion 13, placera motivet musen i kameran. Placera musen i sin naturliga position, ryggen mot kameran, i platt position som möjligt. Denna position är naturligt och lätt reproducerbar. Kryssa automatisk exponerings funktionen och klicka på Skaffa att förvärva baksidan (bakre) bild av djuret, med den automatiska exponeringsfunktionen. OBS: Den automatiska exponeringsfunktionen optimerar exponeringstiden genom att beräkna den från en 1-sek exponering bilden. Om musens bioluminescens signalen är negativ eller mycket låg, kan den optimala exponeringstiden varaautomatiskt in på mer än 20 minuter. I detta fall kan en exponeringstid av 8 till 10 min vara en bra kompromiss. Exponeringstiden kan ställas in manuellt, men bilderna får inte innehålla mättade pixlar. Vänd på musen för att exponera den främre delen av musen till kameran. Försök att platta till mus och sprida sina främre ben, så att de inte blockerar kistan. Skaffa en främre bild av djuret. Kontrollera att kryssrutan autoexponering fortfarande är markerad och klicka igen på "Acquire" -knappen. OBS: Den främre bilden kan förvärvas före den bakre bilden och vice versa. En exponeringstid av mellan främre och bakre bilder kan vara olika beroende på den relativa intensiteten för varje sida av musen. Den beräknas automatiskt när du använder den automatiska exponeringsfunktionen. Kvantifiering använder bara fotonflödet (fotoner per sekund) och är inte beroende av exponeringstiden. Placera musen på en värmande plate eller under en värmande ljus tills den återhämtar sig från bedövningen och sedan placera den tillbaka i sin bur. 6. Bioluminescence Imaging – Efter dag 0 Slå på kameran genom att initiera kameran, stegen, och linserna som i steg 5,1). Söva musen med en intraperitoneal injektion av 60 | il av ketamin (120 mg / kg) / xylazin (6 mg / kg) blandning (se steg 3,1-3,5). OBS: Denna metod för bedövning tillåter avbildning var 5 dagar. För att utföra dagliga avbildning, en metod som använder isofluran som bedövningsmedel och en bioluminescens kameran som lämpar sig för användning med denna bedövningsmedel krävs. Förvärva främre och bakre bilder av djur, med hjälp av den automatiska exponeringsfunktionen, som i steg 5,5) och 5,6). Hantera musen som i steg 5,7). 7. Bioluminescence Kvantifiering och bildanalys OBS: luminoscore Metoden är baserad på bilden analysis. När bilderna har erhållits enligt stegen ovan, kan kvantifieringen genomföras när som helst (inklusive omedelbart efter förvärvet), att associera en luminoscore till varje mus vid varje tidpunkt. Visa "verktygspaletten" genom att klicka på menyn "Visa" och klicka sedan på "verktygspaletten" om den inte redan visas. Klicka på "ROI Tool" fliken i verktygspaletten. Välj "Kontur" -knappen och välj sedan "Free draw". Markera manuellt intresseområdet (ROI) runt musen genom att följa kanterna på musen på framifrån. Stäng konturen med ett högerklick på datormusen. Klicka på "Visa" -menyn och sedan "ROI-mätningar". Se till att "Radiance (fotoner)" har valts i "Measurement Typer" rullande meny längst ner till vänster i "ROI-mätningar" fönstret. Om inte, välj det. Mät sedan foton flux (ph / s) genom att spela in det värde i den "totala Flux [p / s]" låda. OBS: Använd inte Radiance eller någon annan enhet som är i förhållande till ROI ytan. Upprepa steg 7,2) och 7,3) för bakifrån. Summera de två fotonflödes värden som erhållits från fram- och bakifrån. Resultatet är luminoscore. Jämför värdena för varje grupp med hjälp av en lämplig statistisk test (icke-parametriska två-tailed Mann-Whitney-test, till exempel) 14.

Representative Results

Den Luminoscore metod kan användas för kontroll av tumörcellinjektion I modeller som involverar injektion av ett litet antal tumörceller eller när injektionsstället inte tillåter visuell kontroll av injektionen, kan det vara mycket svårt att säkerställa kvaliteten på injektionen. Den luminoscore metoden fungerar som en snabb och bekväm verktyg för att kontrollera kvaliteten på förfarandet och fastställa lätt och omedelbart att allt gick rätt. I båda modellerna, är tumören detekteras så tidigt som 10 min efter injektion (Figur 1A). Bilderna ensam räcka för att kontrollera att tumörceller är närvarande på rätt plats. Ändå kvantifiera bilderna ger en uppfattning om heterogenitet injektionen. Punktdiagrammet (Figur 1B) visar tydligt en skillnad mellan djur som erhöll (svarta prickar) och inte receive (röd linje) injektioner. Intressant nog är den signal som erhålls i SCL modell 100 gånger högre än i den PIOL modellen; denna slutsats stämmer överens med antalet celler injicerades (5 x 10 6 och 1 x 10 4 celler, respektive). Figur 1. Kontroll av Injektion i olika mus lymfkörtel modeller. De luminoscores mätt 10 min efter tumörcell ympning i olika lymfom modeller. (A) Representativa bilder av båda modellerna. (B) Luminoscore av varje djur i de olika modellerna. Den röda linjen motsvarar den genomsnittliga bakgrundsbrus mätt på 10 djur före tumörceller ympning; de prickade linjerna är medelvärdet +/- standardavvikelsen. För varje modell, kan alla djur särskiljas från bakgrundsbrus. I PIOL modellen 1 x 10 4 celler var INOCulated i glaskroppen av det högra ögat, och i SCL-modellen, 5 x 10 6 celler subkutant i varje flanken av musen. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Övervakning tumörbörda och behandlingsrespons Den luminoscore är också ett kraftfullt verktyg för att studera tumörtillväxt och behandlingseffekt. Figur 2A visar representativa bilder av övervakning av tumörtillväxt i kontrollen och CpG behandlade Piol grupper. Mössen ympades med 1 x 10 4 tumörceller vardera, och behandling administrerades in situ på dag 7. Bilderna visar att efter en tillräckligt lång tid (28 dagar), började metastaser för att visas i kontrollgruppen. Även om primärtumören inte verkar känslig för behandling, färremetastaser observerades i CpG-behandlade gruppen (Tabell 1). Kvantitativ analys av tumörbelastningen i varje grupp (figur 2B) visar att CpG saktade tumörutvecklingen, som producerar en statistiskt signifikant skillnad mellan de behandlade och kontrollgruppen efter 28 dagar (icke-parametriska två-tailed Mann-Whitney-test p = 0,0079 ). Icke desto mindre växte tumörerna fortfarande i de behandlade mössen, och ingen av dem överlevde (data visas ej). Detta resultat överensstämmer med tidigare rapporter: CpG har inga signifikanta effekter på primära okulära tumörer 10. Den betydande effekt som vi har här mellan ODN och CpG-gruppen kommer från metastaser tillväxthämning. Figur 2. Övervakning tumörbörda och behandlingsrespons. (A) Representativa bilder av de två grupperna (ODN-kontroll och CpG-behandlade) of PIOL bärande möss. (B) Övervakning tumörbörda med luminoscore. Som framgår på punktdiagram, är effekten av CpG på luminoscore betydande på dag 28. I dessa två grupper, den här metoden har gjort det möjligt att övervaka tumörbörda och att mäta små men signifikant (p = 0,0079) effekterna av CpG- DNA, som inte kunde ha upptäckts av enbart bilder. klicka här för att se en större version av denna siffra. grupper Mus Närvaron av metastaser Plats Fotonflödet (ph / s) CpG 1 Nej X X 2 Ja <td> Eye-dränerande lymp nod 9.32E + 05 3 Nej X X 4 Nej X X 5 Ja Eye-dränerande lymp nod 2.21E + 07 ODN 1 Ja Eye-dränerande lymp nod 1.06E + 07 2 Ja Eye-dränerande lymp nod 7.25E + 07 3 Ja Eye-dränerande lymp nod + kontra 7.64E + 08 4 Ja Eye-dränerande lymp nod + kontra 1.74E + 09 5 Ja Eye-dränerande lymp nod + kontra 9.76E + 07 Tabell 1. Than Luminoscore metod kan anpassas till olika inriktningar Den luminoscore Metoden är inte begränsad till en enda typ av musmodell. Figur 3 visar att det kan anpassas till olika musmodeller. I SCL-modellen, är två tumörer ympas på vardera sidan av musen. Behandlingen administreras in situ till en enda sida på dag 0, och den kontralaterala tumören tjänar som dess kontroll (figur 3A). Därför ingick två ROI dras per mus: en för varje sida (figur 3C). Förhållandet mellan den luminoscore på de behandlade och kontroll sidor beskriver den relativa loppet av varje tumör. Detta förhållande var satt till 1 på dag 0, när behandlingen administrerades. Vi observerade en signifikant minskning i detta förhållande 13 dagar efter behandling administrering (figur 3D, icke-parametrisk två-tailed Mann-Whitney-test p = 0,004). Denna minskning visar att den behandlade sida tumörhar resorberats, såsom visas på de representativa mareld bilder (Figur 3B). Figur 3. Anpassning av Luminoscore metod för att en modell med två primära tumörställen. (A) Experimentell design av en SCL analys. Mössen injicerades med två primära tumörer i varje flank. Ena sidan injiceras med antingen CpG-DNA eller ODN-kontroll, och den andra sidan med PBS, för att tjäna som dess kontroll. (B) Representativa bilder av CpG-behandlade möss och kontrollmöss vid dag 0 och dag 13. Behandlingen administrerades på dag 0. tumör tillväxt hämmades på CpG-behandlade sidan av musen. (C) den manuellt märkt upp regioner av intresse per djur, för två primära tumörställen. (D) förhållandet mellan luminoscores av CpG-behandlade eller ODN-styrsidan och PBS kontrollsidan är ett index somspeglar den relativa tillväxten av varje tumör inom samma djur. Detta förhållande var satt till 1 på dag 0. På dag 13 hade förhållandet mellan CpG-behandlade gruppen minskade signifikant (p = 0,004), avslöjar hämning av tumörtillväxt genom in situ-administrering av CpG-DNA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Ljusabsorptionen av organ och vävnader är fortfarande en begränsning av mareld avbildning, även om denna begränsning är inneboende i varje optisk imaging modalitet. Inom ramen för vår strategi är effekterna av anatomiska strukturer på luminoscore förväntas ha låg variation under förutsättning att studierna genomförs i en viss modell (plats och mus sträng), vilket sedan jämförelser. Bioluminiscens behöver inte excitationsljus och därmed är mer anpassad till hela kroppen in vivo imaging än fluorescens.

Spatial upplösning är också en begränsning av mareld avbildning, och exakt placering av organ som mareld fotoner emitteras fortfarande svårt. Emellertid kan god kunskap om modellen hjälpa i den kvalitativa lokaliseringen av tumörsätena. Den enda utgång i bioluminiscens-baserad metod är luminoscore. Läge påverkar inte luminoscore eftersom den manuella uppräkningen regionen Interest (ROI) täcker hela musen. Slutligen kräver eldflugeluciferas syre. Följaktligen mareld imaging underskattar oftast nekrotiska tumörer. Än en gång, krävs en god kunskap om denna aspekt av modellen.

I detta dokument är vi inte siktar på att bedöma effekten av CpG som en anti-tumörläkemedel (som redan har visats ^7,9,11) utan att beskriva en metod tillåter jämförelse av mareld datamängder. Vi beskriver i själva verket en metod för att kvantifiera tumörbörda avsedda att hjälpa standardisera förvärvsprotokoll för att jämföra olika analyser på olika platser vid olika tidpunkter och som inte kräver datorberäkningar. För att säkerställa reproducerbarhet och korrekt fotonflöde kvantifiering, måste avbildningsanordningen kalibreras med en lätt referens för hemmagjorda enheter eller som rekommenderas av leverantören för kommersiella enheter.

Vår protokoll kräver noggrann uppmärksamhet på flera kritiska points: (i) För det första, är avgörande för att erhålla klara bilder, särskilt i fall med långa exponeringstider kvaliteten av musen anestesi. (Ii) kvantifieringen Enheten måste alltid vara fotonflödet eftersom utstrålning beror på ytan hos varje mus och kan vara irrelevanta för att jämföra olika möss. (Iii) mareld bilder får inte innehålla mättade pixlar, eftersom dessa skulle snedvrida luminoscore. (iv) Fram- och förvärv är skyldiga att samla alla fotoner som avges från tumörstället (dvs kan fram förvärv inte nödvändigtvis detektera fotoner från baksidan av tumören). Olika ROI ritningar testades under utvecklingen av luminoscore metoden. Endast den manuella uppräkningen gav tillfredsställande resultat som är mer benägna att vara statistiskt signifikant (data visas ej).

Inoue et al. rekommendera en luciferin dos av 75 mg / kg ^13. Genom att använda en dos av 150 mg / kg i stället, tidpunkten för avbildning efterluciferin administration förblir oförändrad och vi ser till att platån varar under en lång exponering förvärv. Luciferin måste vara överskottet reaktant hela förvärvsprocessen. Beroende på modell, kan det intressanta området anpassas som vi visade i SCL modell där vi drog två ROI per djur. I SCL modellen behandlingen injiceras när tumören når 0,5 cm i sin största diameter för att begränsa variationen av engraftment. Beroende på möss, skulle tumören har vuxit på olika sätt. Att standardisera och jämföra möss, bestämde vi oss för att använda ett förhållande mellan behandlad och icke-behandlade sidan som visar den relativa tillväxten av båda flank tumörer.

Om ingen signal observeras från en injicerad mus förväntas bli positivt, antingen (i) antalet celler är mycket låg och signalen är under tröskeldetektering; eller (ii) musen saknar syre och kräver omedelbar vård.

Flera av den kvantitativa biolumineschet analyser beskrivs av olika författare kräver komplexa beräkningar och instrument (t.ex. 3D bioluminescens tomografi) för att närma sig den absoluta kvantifiering av utsända mareld fotoner ^5,15. Det finns ingen enighet om en metod för att kvantifiera bioluminiscens reproducerbart, särskilt i tumörmodeller, med en 2D-bioluminiscens kameran. Vårt mål var att standardisera bildförvärvsprotokoll för att begränsa användarberoende.

Injektion av CpG in situ efter tumörinokulering reducerade tumörbördan i båda modellerna. Den luminoscore metod kan fungera som ett verktyg för att övervaka tumörbördan i andra modeller av tumörimmunterapier. Övervakning tumörbörda ger en icke-invasiv metod som kan förbättra vår förståelse av tumörtillväxt och metastaserande mekanismer utan att störa tumörens mikromiljö. Identifiering av djur som gör och inte svarar på behandling med denna metod förstärks genom kontroll av successful tumörcellinjektion vid början av experimentet.

Vi här visade anpassningsförmåga luminoscore metoden i en SCL modell med A20.IIA-luc2 celler. Emellertid kan denna metod anpassas till någon annan tumörmodell med användning av andra cellinjer, förutsatt att de uttrycker luciferas, eller inom ramen för T-cellstudier (tumörspecifika cytotoxiska T-celler, regulatoriska T-celler, etc.). Övervakningen av genöverföring in vivo i samband med genterapi av sällsynt sjukdom kan också göras med hjälp av luminoscore metoden.

Slutligen data visar att mareld baserade luminoscore metod möjliggör jämförelser mellan experiment, erbjuder flexibilitet och anpassningsförmåga till specifika experimentella behov, och är ett användbart verktyg för icke-invasiv longitudinella prekliniska studier.

Materials

CpG 1826	Invivogen	Sequence: 5_-TCCATGACGTTCCTGACGTT Catalog number: tlrl-1826
ODN 1826 control	Invivogen	Sequence: 5_-TCCATGAGCTTCCTGAGCTT Catalog number: tlrl-1826c
D-luciferin potassium salt	Interchim	Catalog number: FP-M1224D
Ketamin	Virbac, France
Xylazin	Bayer Healthcare	Rompun 2%
A20.IIA-luc2 cell line		A20.IIA transfected with pGL4.50[luc2/CMV/hygro]7 (Promega E1310)
Mice	Balb/cByj	Six-weeks old females from Charles River
IVIS lumina Biolumienscence imager	Perkin Elmer
Living Image software	Perkin Elmer	Used for measuring photon flux on images and drawing ROIs
R software (opensource)	R-project	Used for statistic tests
Hamilton Precision Serynge 10µL	Hamilton	Product number 7642-01100
Eye ointment	Lacrinorm
Dissecting microscope	ZEISS	Stemi 305