Mareld avbildning är ett välkänt verktyg för att lokalisera tumörer och metastaser, men kvantifiering av dessa bilder kräver ofta komplexa beräkningar och särskilda instrument. Vi beskriver lättanvända luminoscore metod, baserad på exakta förvärvsvillkor, kräver inga beräkningar, och gör det möjligt för tumörbörda och behandlingsrespons övervakas i musmodeller.
Although bioluminescence imaging (BLI) shows promise for monitoring tumor burden in animal models of cancer, these analyses remain mostly qualitative. Here we describe a method for bioluminescence imaging to obtain a semi-quantitative analysis of tumor burden and treatment response. This method is based on the calculation of a luminoscore, a value that allows comparisons of two animals from the same or different experiments. Current BLI instruments enable the calculation of this luminoscore, which relies mainly on the acquisition conditions (back and front acquisitions) and the drawing of the region of interest (manual markup around the mouse). Using two previously described mouse lymphoma models based on cell engraftment, we show that the luminoscore method can serve as a noninvasive way to verify successful tumor cell inoculation, monitor tumor burden, and evaluate the effects of in situ cancer treatment (CpG-DNA). Finally, we show that this method suits different experimental designs. We suggest that this method be used for early estimates of treatment response in preclinical small-animal studies.
Tidig tumörcell upptäckt fortfarande en utmaning och är avgörande för att förbättra cancerbehandling effekt. In vivo mareld imaging (BLI) är en mycket känslig, icke-invasiv optisk teknik, ofta används för att övervaka tumörer hos små djur. Eldflugeluciferas-uttryckande celler används vanligen för sådana experiment 1,2. Detta oxygenas oxiderar D-luciferin med molekylärt syre men kräver två kofaktorer – Mg 2+ och adenosintrifosfat tre. Eldfluga luciferas är mer lämplig för in vivo-avbildning än Renilla luciferas 4 eftersom dess kvantutbyte är högre.
Den oxiderade substratet – oxyluciferin – avger spontant en foton att återgå till sitt grundtillstånd och sedan blir inaktiv. De emitterade fotonerna har en maximal våglängd runt 530 nm. En högkänslig Kameran kan upptäcka de luminiscerande fotoner från insidan av ett litet djur och ger bilder som gör det möjlible att lokalisera tumörceller.
Förmågan att kvantifiera tumörbörda noggrant genom fotonräkningar skulle kunna fungera som ett kraftfullt och känsligt verktyg för att kvantifiera behandlingseffekt. Eftersom behandlingseffekter kan upptäckas tidigare, kan denna känslighet gör det möjligt att fastställa den exakta tidpunkt då en behandling blir effektiv.
Absolut kvantifiering av den totala emitterade fotonerna är mycket komplex. Antalet fotoner samlats beror på djupet av tumören och på organ fotonerna som släpps ut genom. Korrigeringskoefficienter baserade på vävnads absorptionskoefficienter kan beräknas 5, men absolut kvantifiering av tumörcellantal kräver känna till antalet fotoner som emitteras av varje tumörcell. Dessutom är inte homogen luciferasuttryck, i likhet med många reportergener (t ex., Fluorescerande proteiner), även i en cellpopulation härledd från en enda klon 6. Antalet luciferASE proteiner i celler kan inte beräknas exakt. Fastställandet av standardiserade experimentella betingelser förefaller således avgörande för en tillförlitlig halv kvantitativ analys.
Vi tillämpade luminoscore metod för att två olika mus lymfom modeller 7,8,9. I dessa modeller är syngena tumörceller injiceras i ögat eller under huden för att erhålla respektive en primär intraokulära lymfom (PIOL) modell och en subkutan lymfom (SCL) modell. I vart och ett av dessa orthotopic modeller, är behandlingen administreras på plats, sju dagar efter tumörinokulering för PIOL och när tumören har nått 0,5 till 0,7 cm i sin största diameter för SCL.
Vi använde luminoscore metod för att övervaka effekterna av di situ CpG terapi, som tidigare visat sig vara effektiv 7,10,11. CpG är en oligonukleotidsekvens och en ligand av TLR9, som i sin tur är en intracellulär receptor som uttrycks av många cells i immunsystemet, inklusive dendritiska celler, B-lymfocyter, monocyter och naturliga mördarceller. CpG-DNA är en 20-mer DNA-sekvens som innehåller CpG (CG) immunstimulerande motiv; kontrollen (ODN-kontroll) är samma 20-mer-DNA-sekvens, med undantag av att den immunstimulerande CG-sekvensen är inverterad (GC). TLR9 engagemang i murina lymfom vi studerar inducerar apoptos 10, aktiverar immunförsvaret 12, och därmed avsevärt minskar tumörbörda 7,11.
Här beskriver vi en standardiserad metod för att kvantifiera tumörbörda och behandlingssvar genom självlysande bilder. Denna metod förlitar sig på olika aspekter av avbildningsproceduren, från förvärv till analys, för att optimera tillförlitlighet, reproducerbarhet, icke-användare beroende, och statistisk signifikans. En mareld kvantifiering index tillskrivs varje mus; Detta värde, som vi kallar en luminoscore, kan jämföras inte bara mellan djur men alså mellan experiment.
I detta arbete fokuserar vi på mareld avbildning förfarande samt bild kvantifiering av luminoscore metoden. Vi visar hur effektiv denna metod för att kontrollera injektion, övervakning tumörbörda, och bedöma effekten av in situ cancerbehandling. Var och en av dessa punkter visas i representativa resultat från experiment med användning av olika musmodeller för att markera den anpassningsförmåga luminoscore metoden.
Ljusabsorptionen av organ och vävnader är fortfarande en begränsning av mareld avbildning, även om denna begränsning är inneboende i varje optisk imaging modalitet. Inom ramen för vår strategi är effekterna av anatomiska strukturer på luminoscore förväntas ha låg variation under förutsättning att studierna genomförs i en viss modell (plats och mus sträng), vilket sedan jämförelser. Bioluminiscens behöver inte excitationsljus och därmed är mer anpassad till hela kroppen in vivo imaging än fluorescens.
Spatial upplösning är också en begränsning av mareld avbildning, och exakt placering av organ som mareld fotoner emitteras fortfarande svårt. Emellertid kan god kunskap om modellen hjälpa i den kvalitativa lokaliseringen av tumörsätena. Den enda utgång i bioluminiscens-baserad metod är luminoscore. Läge påverkar inte luminoscore eftersom den manuella uppräkningen regionen Interest (ROI) täcker hela musen. Slutligen kräver eldflugeluciferas syre. Följaktligen mareld imaging underskattar oftast nekrotiska tumörer. Än en gång, krävs en god kunskap om denna aspekt av modellen.
I detta dokument är vi inte siktar på att bedöma effekten av CpG som en anti-tumörläkemedel (som redan har visats 7,9,11) utan att beskriva en metod tillåter jämförelse av mareld datamängder. Vi beskriver i själva verket en metod för att kvantifiera tumörbörda avsedda att hjälpa standardisera förvärvsprotokoll för att jämföra olika analyser på olika platser vid olika tidpunkter och som inte kräver datorberäkningar. För att säkerställa reproducerbarhet och korrekt fotonflöde kvantifiering, måste avbildningsanordningen kalibreras med en lätt referens för hemmagjorda enheter eller som rekommenderas av leverantören för kommersiella enheter.
Vår protokoll kräver noggrann uppmärksamhet på flera kritiska points: (i) För det första, är avgörande för att erhålla klara bilder, särskilt i fall med långa exponeringstider kvaliteten av musen anestesi. (Ii) kvantifieringen Enheten måste alltid vara fotonflödet eftersom utstrålning beror på ytan hos varje mus och kan vara irrelevanta för att jämföra olika möss. (Iii) mareld bilder får inte innehålla mättade pixlar, eftersom dessa skulle snedvrida luminoscore. (iv) Fram- och förvärv är skyldiga att samla alla fotoner som avges från tumörstället (dvs kan fram förvärv inte nödvändigtvis detektera fotoner från baksidan av tumören). Olika ROI ritningar testades under utvecklingen av luminoscore metoden. Endast den manuella uppräkningen gav tillfredsställande resultat som är mer benägna att vara statistiskt signifikant (data visas ej).
Inoue et al. rekommendera en luciferin dos av 75 mg / kg 13. Genom att använda en dos av 150 mg / kg i stället, tidpunkten för avbildning efterluciferin administration förblir oförändrad och vi ser till att platån varar under en lång exponering förvärv. Luciferin måste vara överskottet reaktant hela förvärvsprocessen. Beroende på modell, kan det intressanta området anpassas som vi visade i SCL modell där vi drog två ROI per djur. I SCL modellen behandlingen injiceras när tumören når 0,5 cm i sin största diameter för att begränsa variationen av engraftment. Beroende på möss, skulle tumören har vuxit på olika sätt. Att standardisera och jämföra möss, bestämde vi oss för att använda ett förhållande mellan behandlad och icke-behandlade sidan som visar den relativa tillväxten av båda flank tumörer.
Om ingen signal observeras från en injicerad mus förväntas bli positivt, antingen (i) antalet celler är mycket låg och signalen är under tröskeldetektering; eller (ii) musen saknar syre och kräver omedelbar vård.
Flera av den kvantitativa biolumineschet analyser beskrivs av olika författare kräver komplexa beräkningar och instrument (t.ex. 3D bioluminescens tomografi) för att närma sig den absoluta kvantifiering av utsända mareld fotoner 5,15. Det finns ingen enighet om en metod för att kvantifiera bioluminiscens reproducerbart, särskilt i tumörmodeller, med en 2D-bioluminiscens kameran. Vårt mål var att standardisera bildförvärvsprotokoll för att begränsa användarberoende.
Injektion av CpG in situ efter tumörinokulering reducerade tumörbördan i båda modellerna. Den luminoscore metod kan fungera som ett verktyg för att övervaka tumörbördan i andra modeller av tumörimmunterapier. Övervakning tumörbörda ger en icke-invasiv metod som kan förbättra vår förståelse av tumörtillväxt och metastaserande mekanismer utan att störa tumörens mikromiljö. Identifiering av djur som gör och inte svarar på behandling med denna metod förstärks genom kontroll av successful tumörcellinjektion vid början av experimentet.
Vi här visade anpassningsförmåga luminoscore metoden i en SCL modell med A20.IIA-luc2 celler. Emellertid kan denna metod anpassas till någon annan tumörmodell med användning av andra cellinjer, förutsatt att de uttrycker luciferas, eller inom ramen för T-cellstudier (tumörspecifika cytotoxiska T-celler, regulatoriska T-celler, etc.). Övervakningen av genöverföring in vivo i samband med genterapi av sällsynt sjukdom kan också göras med hjälp av luminoscore metoden.
Slutligen data visar att mareld baserade luminoscore metod möjliggör jämförelser mellan experiment, erbjuder flexibilitet och anpassningsförmåga till specifika experimentella behov, och är ett användbart verktyg för icke-invasiv longitudinella prekliniska studier.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar djurhus i Cordelier Research Center (CEF, Paris, Frankrike), Généthon (Evry, Frankrike) och Genopole (CERFE, Evry, Frankrike). Vi tackar Jo Ann Cahn för sin noggrann läsning av manuskriptet. Denna forskning stöds av Institut National de la Santé et de la Rechercher Médicale, Paris Descartes University, Pierre & Marie Curie universitet, Föreningen pour la Recherche contre le Cancer, den tunisiska Direction Générale de la Recherche Scientifique, den fransk-tunisisk CMCU projekt och åtgärder Thématiques Incitatives de Genopole (ATIGE) medel. JC stöddes av gränser inom Life Science forskarskola och ett stipendium från INCA (Institut National du Cancer). RBA var en mottagare av bidrag från grader-INSERM och CMCU. SD fått ett bidrag från Institut National du Cancer.
CpG 1826 | Invivogen | Sequence: 5_-TCCATGACGTTCCTGACGTT Catalog number: tlrl-1826 |
|
ODN 1826 control | Invivogen | Sequence: 5_-TCCATGAGCTTCCTGAGCTT Catalog number: tlrl-1826c |
|
D-luciferin potassium salt | Interchim | Catalog number: FP-M1224D | |
Ketamin | Virbac, France | ||
Xylazin | Bayer Healthcare | Rompun 2% | |
A20.IIA-luc2 cell line | A20.IIA transfected with pGL4.50[luc2/CMV/hygro]7 (Promega E1310) |
||
Mice | Balb/cByj | Six-weeks old females from Charles River | |
IVIS lumina Biolumienscence imager | Perkin Elmer | ||
Living Image software | Perkin Elmer | Used for measuring photon flux on images and drawing ROIs | |
R software (opensource) | R-project | Used for statistic tests | |
Hamilton Precision Serynge 10µL | Hamilton | Product number 7642-01100 | |
Eye ointment | Lacrinorm | ||
Dissecting microscope | ZEISS | Stemi 305 |