Síntese de nanopartículas de ouro lipossomas Integrated Photo-reactivos e medição das suas microbolhas cavitação em cima do pulso laser de excitação
Summary
Este protocolo descreve um método de preparação simples para nanopartículas de ouro integrado lipossomas foto-sensível com os materiais disponíveis no mercado. Também mostra como medir o processo de cavitação microbolhas dos lipossomas sintetizados mediante o tratamento de laser pulsado.
Abstract
Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control over the drug release. However, most of the relevant technologies are still in the development process and are unprocurable by clinics. Here, we describe a facile fabrication of these photo-responsive NPs with commercially available gold NPs and thermo-responsive liposomes. Calcein is used as a model drug to evaluate the encapsulation efficiency and the release kinetic profile upon heat/light stimulation. Finally, we show that this photo-triggered release is due to the membrane disruption caused by microbubble cavitation, which can be measured with hydrophone.
Introduction
A possibilidade de desencadear a liberação de drogas usando estímulos externos é uma forma atraente para entregar a droga em modas espaço-, temporal- e controlado-dosagem com especificidade maximizada e os efeitos adversos mínimos. Entre uma vasta gama de sistemas exógenos estímulos responsivos (luz, campo magnético, ultra-som, radiação de microondas), plataformas de luz disparado são atraentes, devido à sua não-invasivo, simplicidade e adaptabilidade nas clínicas. 1 Extensas pesquisas na última década tem proporcionado uma variedade de tecnologias de plataforma, como o ouro responsável near-infrared-luz (AU) nanocages revestido com polímeros inteligentes, 2, nanopartículas poliméricas foto-lábil (PN) conjugados com drogas, 3 e nanovesículas porphysome auto-organizadas. 4 Entretanto , estas tecnologias estão ainda nas fases pré-clínicas de desenvolvimento, e requerem uma compreensão clara e optimização dos parâmetros relativos ao processo de iniciação e controlando a libertação do fármaco.
Um dos métodos mais simples e facilmente acessíveis para a preparação de um tal sistema é integrar Au NPs com lipossomas termicamente sensíveis 5,6, ambas as quais estão amplamente disponíveis no mercado e têm sido amplamente investigados em ensaios pré-clínicos e clínicos mesmo. Apesar da limitação da activação de tecidos profundos de Au NPs no seu comprimento de onda plasmónico, quando comparado com nanoestruturas Au-do infravermelho próximo activado (por exemplo, nanocages), este sistema ainda é muito promissora quando usada em pequenos animais ou para entrega tópica em seres humanos. 7 Há alguns esforços iniciais em combinar Au NPs com lipossomas para a liberação de luz disparado. 8-11 Enquanto a maioria deles concentrar-se na novidade de materiais, questões de acessibilidade e escalabilidade precisam ser abordadas. Além disso, os relatórios sobre mecanismos de liberação usando estes nanocarriers ainda são limitados.
Aqui, a fabricação de foto-sensívellipossomas, simultaneamente carregadas com drogas hidrófilas e Au NPs foi descrito. A calceina é utilizado como um composto modelo para avaliar a eficiência da encapsulação e o perfil de libertação do sistema. Além disso, neste sistema, a luz absorvida por Au NPs dissipa para o microambiente envolvente sob a forma de calor, o que resulta em um aumento na temperatura local. Microbolhas de ar são gerados durante o aquecimento a laser e causar ruptura mecânica de lipossomas (Figura 1). O mecanismo da cavitação microbolhas é confirmado por medições de hidrofones.
Protocol
Representative Results
Discussion
hidratação do filme fino é o método convencional para a preparação de lipossomas. Os solventes orgânicos (clorofórmio neste caso) foram primeiro utilizados para dissolver os lipidos e, em seguida, removido num evaporador rotativo a 37 ° C, para gerar uma película fina de lípidos no frasco. Este filme de lípido foi hidratada com a solução aquosa contendo 60 mM de calceína e 5 nm Au NPs. Durante o processo de hidratação, a temperatura foi mantida a cerca de 50 ° C e o frasco foi constantemente agitada po…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi parcialmente financiado pelos Fundos de Pesquisa Acadêmica Tier-1 por Singapura Ministério da Educação (RG 64/12 para CX) e Instituto NTU-Northwestern da nanomedicina.
Materials
| 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) | Avanti Polar Lipids (Alabama, US) | 850355P | Powder, Store at -20 °C |
| 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine (MPPC) | Avanti Polar Lipids (Alabama, US) | 855675P | Powder, Store at -20 °C |
| 1, 2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanol-amine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG2000) | Avanti Polar Lipids (Alabama, US) | 880120P | Powder, Store at -20 °C |
| Gold Nanoparticles | Sigma Aldrich | 752568-100mL | 5nm particles, stabilized at 0.1mM PBS |
| Calcein | Sigma Aldrich | C0875-10g | 60mM, pH 7.4 – adjusted using NaOH |
| phosphate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | P5493 | 0.1 mM, pH 7.4 |
| Double distilled water | Millipore Milli-DI water purification system | ||
| Triton X100 | Sigma, Life Sciences | X-100 | To disrupt the liposomes to calculate total encapsulation |
| Rotavapor | Buchi (Switzerland) | R 210 | Used for Lipososme preparation |
| Heating bath | Buchi (Switzerland) | B 491 | Used for Lipososme preparation |
| Vacuum Controller | Buchi (Switzerland) | V-850 | Used for Lipososme preparation |
| Vacuum Pump | Buchi (Switzerland) | V-700 | Used for Lipososme preparation |
| Recirculation bath with temperature controller | Polyscience | Used for Lipososme preparation | |
| Mini-extruder assembly with heating block | Avanti Polar Lipids (Alabama, US) | 610000 | Used for extrusion of liposomes |
| Syringes, 1000 uL | Avanti Polar Lipids (Alabama, US) | 610017 | Used for extrusion of liposomes |
| Polycarbonate filter membrane, 200nm | Whatmann | 800281 | Used for extrusion of liposomes |
| Filter Support | Avanti Polar Lipids (Alabama, US) | 610014 | Used for extrusion of liposomes |
| PD 10 Desalting coulumns, Sephadex G-25 medium | GE Healthcare, Life sciences | 17-0851-01 | Used to purify the liposomes |
| Centrifuge | Sigma Laboratory Centrifuges | 3K30 | Used to concentrate the liposomal solution |
| Rotor | Sigma | 19777-H | Used to concentrate the liposomal solution |
| Zetasizer | Nano ZS Malvern | Used for the determination of liposome size and zetapotential | |
| UV- Visible Spectrophotometer | Shimadzu | UV-2450 | Used to measure the absorbance of the samples |
| Fluorescent Spectrofluorometer | Molecular Devices | SpectraMax M5 | Used to measure the fluorescence emission of the samples |
| Nd:YAG Laser | NewWave Research | 532 nm; Maximum power: 17mJ; Width: 406 ns; Used for sample irradiation | |
| HNR Hydrophone | ONDA | HNR-1000 | 1000 mm diameter and 450 nV/Pa sensitivity, Proper working frequency range: 0.25-10 MHz; Calibration: 50 mV/Bar; Used to measure the acoustic signals |
| Digital Osciloscope | LECORY – Wave Runner 64Xi-A | Frequency: 600 MHz; Max sample rate : 10 Gs/s (at two channel); Used to record the measured acoustic signals |
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