Sintesi di nanoparticelle d'oro liposomi Integrated Photo-reattiva e la misurazione del loro microbolle cavitazione su impulso laser di eccitazione
Summary
Questo protocollo descrive un metodo di preparazione semplice per nanoparticelle di oro integrato liposomi foto-reattivo con i materiali disponibili commercialmente. Viene inoltre illustrato come misurare il processo di cavitazione di microbolle dei liposomi sintetizzati sul trattamento di laser pulsato.
Abstract
Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control over the drug release. However, most of the relevant technologies are still in the development process and are unprocurable by clinics. Here, we describe a facile fabrication of these photo-responsive NPs with commercially available gold NPs and thermo-responsive liposomes. Calcein is used as a model drug to evaluate the encapsulation efficiency and the release kinetic profile upon heat/light stimulation. Finally, we show that this photo-triggered release is due to the membrane disruption caused by microbubble cavitation, which can be measured with hydrophone.
Introduction
La possibilità di innescare il rilascio del farmaco utilizzando stimoli esterni è un modo interessante per consegnare la droga a mode spazio-, temporo e dosaggio controllato con specificità massimizzata e minimi effetti avversi. Tra una vasta gamma di sistemi esogeni stimoli-reattiva (luce, campo magnetico, ultrasuoni, radiazioni a microonde), piattaforme di luce-triggered sono attraenti, a causa della loro non invasività, semplicità e adattabilità negli ambulatori. 1 Ricerche approfondite negli ultimi dieci anni ha fornito una varietà di tecnologie di piattaforma, come l'oro responsabile nel vicino infrarosso-luce (Au) nanocages rivestiti con polimeri intelligenti, 2 foto-labile, nanoparticelle polimeriche (NP) coniugati con farmaci, 3 e nanovesicles porphysome auto-assemblati. 4 Tuttavia , queste tecnologie sono ancora in fase di sviluppo preclinico, e richiedono una comprensione chiara e ottimizzazione dei parametri legati al processo di avvio e controtolare il rilascio del farmaco.
Uno dei metodi più semplici e facilmente accessibili per la preparazione di un tale sistema è quello di integrare le Au NP con liposomi termicamente sensibili 5,6, entrambi i quali sono ampiamente disponibili sul mercato e sono stati ampiamente studiati in studi preclinici e clinici, anche. Nonostante la limitazione dell'attivazione del tessuto profondo di Au NP alla loro lunghezza d'onda plasmonica, se confrontato con nanostrutture vicino infrarosso attivato Au (ad esempio, nanocages), questo sistema mantiene ancora una grande promessa se usato nei piccoli animali o per la consegna di attualità negli esseri umani. 7 ci sono alcuni primi sforzi in combinando Au NP con liposomi per il rilascio di luce-attivato. 8-11 Mentre la maggior parte di essi riguardano sulla novità dei materiali, problemi di accessibilità e scalabilità devono essere affrontati. Inoltre, i rapporti sui meccanismi di rilascio che utilizzano questi nanovettori sono ancora limitate.
Qui, la fabbricazione di foto-sensibileliposomi, allo stesso tempo carichi di farmaci e idrofili Au NP è stata descritta. Calceina viene utilizzato come composto modello per valutare l'efficienza di incapsulamento e il profilo di rilascio del sistema. Inoltre, in questo sistema, luce assorbita da Au NP dissipa il microambiente circostante sotto forma di calore, con conseguente aumento della temperatura locale. Microbolle d'aria vengono generati durante il riscaldamento laser e causano distruzione meccanica dei liposomi (Figura 1). Il meccanismo della cavitazione microbolle è confermato da misurazioni idrofoni.
Protocol
Representative Results
Discussion
idratazione film sottile è il metodo convenzionale per la preparazione di liposomi. Solventi organici (cloroformio in questo caso) sono stati usati per primo dissolvere i lipidi e poi rimosso in un evaporatore rotante a 37 ° C per generare un sottile film lipidico sul pallone. Questo film lipidico venne idratato con la soluzione acquosa contenente 60 mM calceina e 5 nm Au NP. Durante il processo di idratazione, la temperatura è stata mantenuta a circa 50 ° C e il pallone viene agitato costantemente ruotando il pallo…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato parzialmente supportato dagli accademici fondi Tier-1 ricerca per Singapore Ministero della Pubblica Istruzione (RG 64/12 di CX) e NTU-Northwestern Istituto di nanomedicina.
Materials
| 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) | Avanti Polar Lipids (Alabama, US) | 850355P | Powder, Store at -20 °C |
| 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine (MPPC) | Avanti Polar Lipids (Alabama, US) | 855675P | Powder, Store at -20 °C |
| 1, 2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanol-amine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG2000) | Avanti Polar Lipids (Alabama, US) | 880120P | Powder, Store at -20 °C |
| Gold Nanoparticles | Sigma Aldrich | 752568-100mL | 5nm particles, stabilized at 0.1mM PBS |
| Calcein | Sigma Aldrich | C0875-10g | 60mM, pH 7.4 – adjusted using NaOH |
| phosphate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | P5493 | 0.1 mM, pH 7.4 |
| Double distilled water | Millipore Milli-DI water purification system | ||
| Triton X100 | Sigma, Life Sciences | X-100 | To disrupt the liposomes to calculate total encapsulation |
| Rotavapor | Buchi (Switzerland) | R 210 | Used for Lipososme preparation |
| Heating bath | Buchi (Switzerland) | B 491 | Used for Lipososme preparation |
| Vacuum Controller | Buchi (Switzerland) | V-850 | Used for Lipososme preparation |
| Vacuum Pump | Buchi (Switzerland) | V-700 | Used for Lipososme preparation |
| Recirculation bath with temperature controller | Polyscience | Used for Lipososme preparation | |
| Mini-extruder assembly with heating block | Avanti Polar Lipids (Alabama, US) | 610000 | Used for extrusion of liposomes |
| Syringes, 1000 uL | Avanti Polar Lipids (Alabama, US) | 610017 | Used for extrusion of liposomes |
| Polycarbonate filter membrane, 200nm | Whatmann | 800281 | Used for extrusion of liposomes |
| Filter Support | Avanti Polar Lipids (Alabama, US) | 610014 | Used for extrusion of liposomes |
| PD 10 Desalting coulumns, Sephadex G-25 medium | GE Healthcare, Life sciences | 17-0851-01 | Used to purify the liposomes |
| Centrifuge | Sigma Laboratory Centrifuges | 3K30 | Used to concentrate the liposomal solution |
| Rotor | Sigma | 19777-H | Used to concentrate the liposomal solution |
| Zetasizer | Nano ZS Malvern | Used for the determination of liposome size and zetapotential | |
| UV- Visible Spectrophotometer | Shimadzu | UV-2450 | Used to measure the absorbance of the samples |
| Fluorescent Spectrofluorometer | Molecular Devices | SpectraMax M5 | Used to measure the fluorescence emission of the samples |
| Nd:YAG Laser | NewWave Research | 532 nm; Maximum power: 17mJ; Width: 406 ns; Used for sample irradiation | |
| HNR Hydrophone | ONDA | HNR-1000 | 1000 mm diameter and 450 nV/Pa sensitivity, Proper working frequency range: 0.25-10 MHz; Calibration: 50 mV/Bar; Used to measure the acoustic signals |
| Digital Osciloscope | LECORY – Wave Runner 64Xi-A | Frequency: 600 MHz; Max sample rate : 10 Gs/s (at two channel); Used to record the measured acoustic signals |
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