Síntesis de nanopartículas de oro liposomas Integrado fotosensible y la medición de su microburbujas cavitación al pulso láser de excitación
Summary
Este protocolo describe un método de preparación sencilla para nanopartículas de oro liposomas fotosensible integrado con los materiales disponibles en el mercado. También muestra cómo medir el proceso de cavitación de las microburbujas de los liposomas sintetizados en el tratamiento de láser pulsado.
Abstract
Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control over the drug release. However, most of the relevant technologies are still in the development process and are unprocurable by clinics. Here, we describe a facile fabrication of these photo-responsive NPs with commercially available gold NPs and thermo-responsive liposomes. Calcein is used as a model drug to evaluate the encapsulation efficiency and the release kinetic profile upon heat/light stimulation. Finally, we show that this photo-triggered release is due to the membrane disruption caused by microbubble cavitation, which can be measured with hydrophone.
Introduction
La posibilidad de desencadenar la liberación del fármaco mediante estímulos externos es una forma atractiva para entregar los medicamentos en las modas espacialidad, temporalidad y dosificación controlada con especificidad maximizada y efectos adversos mínimos. Entre una amplia gama de sistemas exógenos estímulos que responden (la luz, el campo magnético, ultrasonido, radiación de microondas), plataformas de luz provocada son atractivos, debido a su carácter no invasivo, la sencillez y la adaptabilidad en las clínicas. 1 Una amplia investigación en la última década ha proporcionado una variedad de tecnologías de plataforma, como el oro responsables del infrarrojo cercano luz (Au) nano-cajas recubiertas con polímeros inteligentes, 2, nanopartículas poliméricas foto-lábil (NPS) conjugados con fármacos, 3 y nanovesículas porphysome autoensambladas. 4 Sin embargo , estas tecnologías están aún en las etapas preclínicas de desarrollo, y requieren una comprensión clara y optimización de los parámetros que intervienen en el proceso de iniciar y controdar la liberación del fármaco.
Uno de los métodos más simples y de fácil acceso para la preparación de un sistema de este tipo es la integración de Au NPs con liposomas térmicamente sensibles 5,6, ambos de los cuales están ampliamente disponibles en el mercado y han sido ampliamente investigados en ensayos preclínicos y clínicos aún. A pesar de la limitación de la activación de tejido profundo de Au NPs en su longitud de onda plasmónica, en comparación con Au nanoestructuras del infrarrojo cercano activado (por ejemplo, nano-cajas), este sistema todavía una gran promesa cuando se utiliza en animales pequeños o para la administración tópica en los seres humanos. 7 Hay algunos esfuerzos tempranos en la combinación de Au PN con liposomas para la liberación luz disparado. 8-11 Si bien la mayoría de ellos se centran en la novedad de los materiales, los problemas de accesibilidad y escalabilidad deben ser abordados. Por otra parte, los informes sobre los mecanismos de liberación que utilizan estos nanoportadores son todavía limitados.
En este documento, la fabricación de foto-sensibleliposomas, cargados simultáneamente con las drogas y el hidrófilos Au NPs se ha descrito. Calceína se utiliza como un compuesto modelo para evaluar la eficacia de encapsulación y el perfil de liberación del sistema. Además, en este sistema, la luz absorbida por Au NPs disipa al microambiente que rodea en forma de calor, lo que resulta en un aumento de la temperatura local. Microburbujas de aire se generan durante el calentamiento por láser y causan la rotura mecánica de liposomas (Figura 1). El mecanismo de la cavitación de las microburbujas se confirmó por mediciones de hidrófonos.
Protocol
Representative Results
Discussion
hidratación de película delgada es el método convencional para la preparación de liposomas. disolventes orgánicos (cloroformo en este caso) se utilizó por primera vez para disolver los lípidos y luego se retiraron en un evaporador rotatorio a 37 ° C para generar una fina película lipídica en el matraz. Esta película de lípido se hidrató con la solución acuosa que contiene 60 mM de calceína y 5 nm Au NPs. Durante el proceso de hidratación, la temperatura se mantuvo alrededor de 50 ° C y el matraz se agit…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue parcialmente apoyado por los Fondos de Investigación Académica de nivel 1 por Singapur Ministerio de Educación (RG 64/12 al CX) y el Instituto NTU-Noroeste de Nanomedicina.
Materials
| 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) | Avanti Polar Lipids (Alabama, US) | 850355P | Powder, Store at -20 °C |
| 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine (MPPC) | Avanti Polar Lipids (Alabama, US) | 855675P | Powder, Store at -20 °C |
| 1, 2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanol-amine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG2000) | Avanti Polar Lipids (Alabama, US) | 880120P | Powder, Store at -20 °C |
| Gold Nanoparticles | Sigma Aldrich | 752568-100mL | 5nm particles, stabilized at 0.1mM PBS |
| Calcein | Sigma Aldrich | C0875-10g | 60mM, pH 7.4 – adjusted using NaOH |
| phosphate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | P5493 | 0.1 mM, pH 7.4 |
| Double distilled water | Millipore Milli-DI water purification system | ||
| Triton X100 | Sigma, Life Sciences | X-100 | To disrupt the liposomes to calculate total encapsulation |
| Rotavapor | Buchi (Switzerland) | R 210 | Used for Lipososme preparation |
| Heating bath | Buchi (Switzerland) | B 491 | Used for Lipososme preparation |
| Vacuum Controller | Buchi (Switzerland) | V-850 | Used for Lipososme preparation |
| Vacuum Pump | Buchi (Switzerland) | V-700 | Used for Lipososme preparation |
| Recirculation bath with temperature controller | Polyscience | Used for Lipososme preparation | |
| Mini-extruder assembly with heating block | Avanti Polar Lipids (Alabama, US) | 610000 | Used for extrusion of liposomes |
| Syringes, 1000 uL | Avanti Polar Lipids (Alabama, US) | 610017 | Used for extrusion of liposomes |
| Polycarbonate filter membrane, 200nm | Whatmann | 800281 | Used for extrusion of liposomes |
| Filter Support | Avanti Polar Lipids (Alabama, US) | 610014 | Used for extrusion of liposomes |
| PD 10 Desalting coulumns, Sephadex G-25 medium | GE Healthcare, Life sciences | 17-0851-01 | Used to purify the liposomes |
| Centrifuge | Sigma Laboratory Centrifuges | 3K30 | Used to concentrate the liposomal solution |
| Rotor | Sigma | 19777-H | Used to concentrate the liposomal solution |
| Zetasizer | Nano ZS Malvern | Used for the determination of liposome size and zetapotential | |
| UV- Visible Spectrophotometer | Shimadzu | UV-2450 | Used to measure the absorbance of the samples |
| Fluorescent Spectrofluorometer | Molecular Devices | SpectraMax M5 | Used to measure the fluorescence emission of the samples |
| Nd:YAG Laser | NewWave Research | 532 nm; Maximum power: 17mJ; Width: 406 ns; Used for sample irradiation | |
| HNR Hydrophone | ONDA | HNR-1000 | 1000 mm diameter and 450 nV/Pa sensitivity, Proper working frequency range: 0.25-10 MHz; Calibration: 50 mV/Bar; Used to measure the acoustic signals |
| Digital Osciloscope | LECORY – Wave Runner 64Xi-A | Frequency: 600 MHz; Max sample rate : 10 Gs/s (at two channel); Used to record the measured acoustic signals |
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