Ex Vivo optogenetische Dissection of Fear Circuits in Brain Slices
Summary
Optogenetische benaderingen worden wijd gebruikt om neurale activiteit te manipuleren en de gevolgen voor hersenfunctie beoordelen. Hier, wordt een techniek beschreven die bij in vivo expressie van het optische activator Channelrhodopsin, maakt de ex vivo analyse van synaptische eigenschappen specifieke lange afstand en lokale neurale verbindingen in angst gerelateerde circuits.
Abstract
Optogenetische benaderingen worden nu op grote schaal gebruikt om de functie van neurale populaties en circuits te bestuderen door het combineren van gerichte expressie van licht geactiveerd eiwitten en daaropvolgende manipulatie van neurale activiteit door licht. Channelrhodopsins (CHR) zijn licht-gated kation-kanalen en wanneer gefuseerd aan een fluorescerend eiwit hun expressie maakt visualisatie en gelijktijdige activering van specifieke celtypen en hun axonale uitsteeksels in bepaalde hersengebieden. Via stereotactische injectie van virale vectoren, kunnen chr fusie-eiwitten constitutief of voorwaardelijk worden uitgedrukt in specifieke cellen van een bepaald hersengebied, en hun axonale projecties kan vervolgens anatomisch en functioneel worden bestudeerd via ex vivo optogenetic activatie in de hersenen plakjes. Dit is van bijzonder belang wanneer gericht op synaptische eigenschappen van verbindingen die niet met gebruikelijke elektrische stimulatie benaderingen kunnen worden aangepakt begrijpen of kunnen nieuwe affehuurprijs en efferente connectiviteit die eerder was slecht begrepen. Hier enkele voorbeelden hoe deze techniek kan worden toegepast op deze vragen ophelderen angst-gerelateerde circuits in de amygdala onderzoeken. De amygdala is een belangrijke regio voor het verwerven en expressie van angst, en de opslag van angst en emotionele herinneringen. Vele lijnen van bewijs suggereren dat de mediale prefrontale cortex (mPFC) neemt deel aan verschillende aspecten van angst acquisitie en extinctie, maar de precieze connectiviteit met de amygdala is net begonnen te begrijpen. Ten eerste wordt getoond hoe ex vivo optogenetic activering kan worden gebruikt om aspecten van synaptische communicatie tussen mPFC afferenten en target cellen te bestuderen in de basolaterale amygdala (BLA). Verder wordt geïllustreerd hoe dit ex vivo optogenetic benadering kan worden toegepast op nieuwe connectiviteitspatronen behulp van een groep van GABAerge neuronen in de amygdala beoordelen, de paracapsular geïntercaleerde celcluster (mpITC) als voorbeeld.
Introduction
Nauwkeurige instrumenten voor visualisatie en gelijktijdige activering van specifieke verbindingen tussen hersengebieden en specifieke typen neuronen worden steeds belangrijker in het begrijpen van de functionele connectiviteit onderliggende gezonde hersenfunctie en ziektebeelden. Idealiter dit met zich meebrengt fysiologisch onderzoek naar nauwkeurige synaptische eigenschappen waarmee geïdentificeerde neuronen communiceren. Dit geldt met name voor verbindingen tussen hersengebieden die in één enkele plak acute hersenen kan worden behouden. In het verleden is dit grotendeels bereikt in afzonderlijke experimenten. Enerzijds, neurale tracers geïnjecteerd in vivo zijn gebruikt in combinatie met daaropvolgende licht- of elektronenmicroscopische analyse van pre- en postsynaptische partners. Anderzijds, wanneer zenuwbanen van het gebied van herkomst bewaard en toegankelijk in de slice voorbereiding, elektrische stimulatie is gebruikt om synaptische communicatiemechanismen ervan met cellen in het doelgebied.
Met de komst van optogenetics, de gerichte expressie van licht-gated kation-kanalen, zoals Channelrhodopsins (CHR) gefuseerd aan fluorescerende eiwitten, zodat nu activatie van neuronen en hun axonale trajecten terwijl voor de visualisatie en post-hoc analyse anatomische 1- 4. Omdat CHR-expressie axonen ook kan worden gestimuleerd wanneer gescheiden van ouder somata 5, kan in de hersenen plakjes: 1) beoordelen input van hersengebieden die niet toegankelijk zijn met gebruikelijke elektrische stimulatie genoemd, omdat zenuwbanen niet splitsbaar of specifieke traject is niet bekend; 2) ondubbelzinnig de regio van herkomst voor specifieke inputs die werden vooropgesteld, maar onvolledig begrepen te identificeren; en 3) het onderzoeken van de functionele connectiviteit tussen gedefinieerde celtypes, zowel lokaal als in de lange-afstands projecties. Door een aantal voordelen, heeft deze optogenetic mapping circuits in hersenplakken breed gewordenly gebruikt in de afgelopen jaren, en verschillende virale vectoren voor expressie van fluorescent-gelabeld CHRS zijn verkrijgbaar bij commerciële leveranciers. Enkele belangrijke voordelen van optogenetic activering via conventionele elektrische stimulatie geen schade aan het weefsel door de plaatsing van de stimulatie-elektroden, specificiteit vezels stimulatie omdat elektrische stimulatie ook vezels van doorgang of andere nabijgelegen cellen, en een even snelle en temporeel precieze stimulatie werven. Bovendien kan stereotactische injectie van virale vectoren gemakkelijk worden gericht op specifieke hersengebieden 6 en voorwaardelijke of celtype specifieke expressie kan worden verkregen door Cre-afhankelijke expressie en / of specifieke promoters 7. Hier, wordt deze techniek toegepast voor het in kaart brengen van de lange afstand en de plaatselijke omlopen in de vreze systeem.
De amygdala is een belangrijke regio voor het verwerven en expressie van angst, en de opslag van angst en emotionele herinneringen 8,9. Apart weerm de amygdala, de mediale prefrontale cortex (mPFC) en hippocampus (HC), structuren die onderling zijn verbonden met de amygdala, zijn betrokken bij aspecten van acquisitie, consolidatie en ophalen van angst en extinctie geheugens 10,11. Activiteit in de deelsectoren van de mPFC lijkt een dubbele rol te spelen bij de bestrijding van zowel hoge als lage angst verklaart 12,13. Dit kan voor een deel worden veroorzaakt door rechtstreekse verbindingen vanuit mPFC naar de amygdala dat de amygdala-activiteit en de output zou controleren. Daarom is in de afgelopen jaren hebben verschillende studies begonnen in ex vivo experimenten slice synaptische interacties tussen mPFC afferenten en specifieke doelcellen te onderzoeken in de amygdala 14-17.
Tijdens angst leren, sensorische informatie over airconditioning en ongeconditioneerde stimuli bereikt de amygdala via projecties van specifieke thalamische en corticale gebieden. Plasticiteit van deze ingangen neuronen in het laterale deel (la) van de Basolateral amygdala (BLA) is een belangrijk mechanisme dat ten grondslag vreesconditionering 9,18. Steeds meer bewijs suggereert dat parallelle plastic processen in de amygdala te betrekken remmende elementen om angst geheugen 19 te controleren. Een groep van geclusterde remmende neuronen zijn de GABAergic mediale paracapsular ingelast cellen (mpITCs), maar hun precieze verbinding en de functie is onvolledig begrepen 20-22. Hier wordt optogenetic circuit mapping gebruikt om afferente en efferente connectiviteit van deze cellen en hun impact op de doelgroep neuronen in de amygdala te beoordelen, waaruit blijkt dat mpITCs ontvangen directe zintuiglijke input van thalamus en corticale relay stations 23. Specifieke expressie van CHR in mpITCs of BLA neuronen maakt het in kaart brengen van de lokale interacties, waaruit blijkt dat mpITCs remmen, maar ook onderling geactiveerd door, BLA opdrachtgever neuronen, ze te plaatsen in de roman van feed-forward en feedback remmende circuits die effectief BLA activiteit te controleren23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol beschrijft een werkwijze voor ex vivo optogenetic onderzoek van neurale circuits en lokale verbindingen die gemakkelijk kunnen worden toegepast op de meeste, zo niet alle, rechte segment patch-clamp setups door hen uit te rusten met een ~ 470 nm LED op epifluorescentie lichtpoort. Een groot voordeel van optogenetic stimulatie van axonale uitsteeksels in plakjes is dat het specifieke activatie en onderzoeken van eigenschappen van verbindingen die niet toegankelijk zijn met gebruikelijke elektrische …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Cora Hübner and Andrea Gall for help in acquiring some of the representative results. This work was supported by the Werner Reichardt Centre for Integrative Neuroscience (CIN) at the University of Tuebingen, an Excellence Initiative funded by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) within the framework of the Excellence Initiative (EXC 307), and by funds from the Charitable Hertie Foundation.
Materials
| Surgery | |||
| Stereotactic frame | Stoelting, USA | 51670 | can be replaced by other stereotactic frame for mice |
| Steretoxic frame mouse adaptor | Stoelting, USA | 51625 | |
| Gas anesthesia mask for mice | Stoelting, USA | 50264 | no longer available, replaced by item no. 51609M |
| Pressure injection device, Toohey Spritzer | Toohey Company, USA | T25-2-900 | other pressure injection devices (e.g. Picospritzer) can be used |
| Kwik Fill glass capillaries | World Precision Instruments, Germany | 1B150F-4 | |
| Anesthesia machine, IsoFlo | Eickemeyer, Germany | 213261 | |
| DC Temperature Controler and heating pad | FHC, USA | 40-90-8D | |
| Horizontal Micropipette Puller Model P-1000 | Sutter Instruments, USA | P-1000 | |
| Surgical tool sterilizer, Sterilizator 75 | Melag, Germany | 08754200 | |
| rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotype 2/9) | Penn Vector Core, USA | AV-9-26973P | |
| rAAV-CAGh-ChR2(H134R)-mCherry (serotype 2/9) | Penn Vector Core, USA | AV-9-20938M | |
| rAAV-EF1a-DIOhChR2(H134R)-YFP (serotype 2/1) | Penn Vector Core, USA | AV-1-20298P | |
| fast green | Roth, Germany | 0301.1 | |
| Isoflurane Anesthetic, Isofuran CP (1ml/ml) | CP Pharma, Germany | ||
| Antiseptic, Betadine (providone-iodine) | Purdure Products, USA | BSOL32 | can be replaced by other disinfectant |
| Analgesic, Metacam Solution (5mg/ml meloxicam) | Boehringer Ingelheim, Germany | can be replaced by other analgesics | |
| Bepanthen eye ointment | Bayer, Germany | 0191 | can be replaced by other eye ointment |
| Drill NM3000 (SNKG1341 and SNIH1681) | Nouvag, Switzerland | ||
| Sutranox Suture Needle | Fine Science Tools, Germany | 12050-01 | |
| Braided Silk Suture | Fine Science Tools, Germany | 18020-60 | |
| Recordings, light stimulation, and analysis | |||
| artificial cerebrospinal fluid (ACSF) | for composition see references #16 and #23 | ||
| internal patch solutions | for composition see references #16 and #23 | ||
| MagnesiumSulfate Heptahydrate | Roth, Germany | P027.1 | prepare 2M stock solution in purified water |
| Slicer, Microm HM650V | Fisher Scientific, Germany | 920120 | |
| Cooling unit for tissue slicer, CU65 | Fisher Scientific, Germany | 770180 | |
| Sapphire blade | Delaware Diamond Knives | custom order, inquire with company | |
| Stereoscope, SZX2-RFA16 | Olympus, Japan | ||
| Xcite fluorescent lamp (XI120Q-1492) | Lumen Dynamics Group, Canada | 2012-12699 | |
| Patch microscope, BX51WI | Olympus, Japan | ||
| Multiclamp 700B patch amplifier | Molecular Devices, USA | ||
| Digitdata 1440A | Molecular Devices, USA | ||
| PClamp software, Version 10 | Molecular Devices, USA | used to control data acquisition and stimulation | |
| Bath temperature controler, TC05 | Luigs & Neumann, Germany | 200-100 500 0145 | |
| Three axis micromanipulator Mini 25 | Luigs & Neumann, Germany | 210-100 000 0010 | |
| Micromanipulator controller SM7 | Luigs & Neumann, Germany | 200-100 900 7311 | |
| glass capillaries for patch pipettes | World Precision Instruments, Germany | GB150F-8P | |
| Cellulose nitrate filterpaper for interface chamber | Satorius Stedim Biotech, Germany | 13006–50—-ACN | |
| LED unit, CoolLED pE | CoolLED, UK | 244-1400 | CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation |
| CoolLED 100 Dual Adapt | CoolLED, UK | pE-ADAPTOR-50E | |
| LED unit, USL 70/470 | Rapp Optoelectronic | L70-000 | |
| Dual port adapter | Rapp Optoelectronic | inquire with company | |
| Filter set red (excitation) | AHF, Germany | F49-560 | Filters can be bought as set F46-008 |
| (beamsplitter) | AHF, Germany | F48-585 | |
| (emission) | AHF, Germany | F47-630 | |
| Filter set green (excitation) | AHF, Germany | F39-472 | Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission) |
| (beamsplitter) | AHF, Germany | F43-495W | |
| (emission) | AHF, Germany | F76-490 | |
| LaserCheck, handheld power meter | Coherent, USA | 1098293 | |
| IgorPro Software, Version 6 | Wavemetrics, USA | for electrophysiology data analysis, other alternative software packages can also be used | |
| Neuromatic suite of macros for IgorPro | http://www.neuromatic.thinkrandom.com | ||
| Post hoc analysis of injections and projections | |||
| Paraformaldehyde powder (PFA) | Roth, Germany | 0335.2 | |
| Neurotrace 435/455 blue fluorescent Nissl stain | Invitrogen | N-21479 | |
| agar-agar for embedding and resectioning | Roth, Germany | 5210.3 | |
| 30 x 10 mm petri dishes for embedding | SPL Life Sciences | alternatives can be used | |
| Slides, Super Frost | R. Langenbrinck, Germany | 61303802 | alternatives can be used |
| cover slips | R. Langenbrinck, Germany | 3000302 | alternatives can be used |
| Vecta Shield mounting medium | Vector Laboratories, USA | H-1000 | alternative mounting media can be used |
| cellulose nitrate filter for flattening slices for fixation | Satorius Stedim Biotech, Germany | 11406–25——N | |
| Confocal Laser Scanning Microscope LSM 710 | Zeiss, Germany | ||
Riferimenti
- Nagel, G. et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940-13945, (2003).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., & Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268, (2005).
- Tye, K. M., & Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nat Rev Neurosci. 13 (4), 251-266, (2012).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., & Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34, (2011).
- Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., & Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nat Neurosci. 10 (5), 663-668, (2007).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., & Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat Protoc. 1 (6), 3166-3173, (2006).
- Huang, Z. J., & Zeng, H. Genetic approaches to neural circuits in the mouse. Annu Rev Neurosci. 36, 183-215, (2013).
- LeDoux, J. E. Emotion circuits in the brain. Annu Rev Neurosci. 23, 155-184, (2000).
- Pape, H. C., & Pare, D. Plastic synaptic networks of the amygdala for the acquisition, expression, and extinction of conditioned fear. Physiol Rev. 90 (2), 419-463, (2010).
- Myers, K. M., & Davis, M. Mechanisms of fear extinction. Mol Psychiatry. 12 (2), 120-150, (2007).
- Quirk, G. J., & Mueller, D. Neural mechanisms of extinction learning and retrieval. Neuropsychopharmacology. 33 (1), 56-72, (2008).
- Vidal-Gonzalez, I., Vidal-Gonzalez, B., Rauch, S. L., & Quirk, G. J. Microstimulation reveals opposing influences of prelimbic and infralimbic cortex on the expression of conditioned fear. Learn Mem. 13 (6), 728-733, (2006).
- Sierra-Mercado, D., Padilla-Coreano, N., & Quirk, G. J. Dissociable roles of prelimbic and infralimbic cortices, ventral hippocampus, and basolateral amygdala in the expression and extinction of conditioned fear. Neuropsychopharmacology. 36 (2), 529-538, (2011).
- Cho, J. H., Deisseroth, K., & Bolshakov, V. Y. Synaptic encoding of fear extinction in mPFC-amygdala circuits. Neuron. 80 (6), 1491-1507, (2013).
- Arruda-Carvalho, M., & Clem, R. L. Pathway-Selective Adjustment of Prefrontal-Amygdala Transmission during Fear Encoding. J Neurosci. 34 (47), 15601-15609, (2014).
- Hubner, C., Bosch, D., Gall, A., Luthi, A., & Ehrlich, I. Ex vivo dissection of optogenetically activated mPFC and hippocampal inputs to neurons in the basolateral amygdala: implications for fear and emotional memory. Front Behav Neurosci. 8, 64, (2014).
- Strobel, C., Marek, R., Gooch, H. M., Sullivan, R. K., & Sah, P. Prefrontal and Auditory Input to Intercalated Neurons of the Amygdala. Cell Rep. 10 (9), 1435-1442, (2015).
- Sigurdsson, T., Doyere, V., Cain, C. K., & LeDoux, J. E. Long-term potentiation in the amygdala: a cellular mechanism of fear learning and memory. Neuropharmacology. 52 (1), 215-227, (2007).
- Ehrlich, I., Humeau, Y., Grenier, F., Ciocchi, S., Herry, C., & Luthi, A. Amygdala inhibitory circuits and the control of fear memory. Neuron. 62 (6), 757-771, (2009).
- Millhouse, O. E. The intercalated cells of the amygdala. J Comp Neurol. 247 (2), 246-271, (1986).
- Busti, D. et al. Different fear states engage distinct networks within the intercalated cell clusters of the amygdala. J Neurosci. 31 (13), 5131-5144, (2011).
- Palomares-Castillo, E., Hernandez-Perez, O. R., Perez-Carrera, D., Crespo-Ramirez, M., Fuxe, K., & Perez de la Mora, M. The intercalated paracapsular islands as a module for integration of signals regulating anxiety in the amygdala. Brain Res. 1476, 211-234, (2012).
- Asede, D., Bosch, D., Luthi, A., Ferraguti, F., & Ehrlich, I. Sensory inputs to intercalated cells provide fear-learning modulated inhibition to the basolateral amygdala. Neuron. 86 (2), 541-554, (2015).
- Tamamaki, N., Yanagawa, Y., Tomioka, R., Miyazaki, J., Obata, K., & Kaneko, T. Green fluorescent protein expression and colocalization with calretinin, parvalbumin, and somatostatin in the GAD67-GFP knock-in mouse. J Comp Neurol. 467 (1), 60-79, (2003).
- Mar, L., Yang, F. C., & Ma, Q. Genetic marking and characterization of Tac2-expressing neurons in the central and peripheral nervous system. Mol Brain. 5, 3, (2012).
- Jackman, S. L., Beneduce, B. M., Drew, I. R., & Regehr, W. G. Achieving high-frequency optical control of synaptic transmission. J Neurosci. 34 (22), 7704-7714, (2014).
- Li, H., Penzo, M. A., Taniguchi, H., Kopec, C. D., Huang, Z. J., & Li, B. Experience-dependent modification of a central amygdala fear circuit. Nat Neurosci. 16 (3), 332-339, (2013).
- Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., & Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457 (7233), 1142-1145, (2009).
- Felix-Ortiz, A. C., Beyeler, A., Seo, C., Leppla, C. A., Wildes, C. P., & Tye, K. M. BLA to vHPC inputs modulate anxiety-related behaviors. Neuron. 79 (4), 658-664, (2013).
- Chu, H. Y., Ito, W., Li, J., & Morozov, A. Target-specific suppression of GABA release from parvalbumin interneurons in the basolateral amygdala by dopamine. J Neurosci. 32 (42), 14815-14820, (2012).
- Zhang, Y. P., & Oertner, T. G. Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel. Nat Methods. 4 (2), 139-141, (2007).
- Britt, J. P., Benaliouad, F., McDevitt, R. A., Stuber, G. D., Wise, R. A., & Bonci, A. Synaptic and behavioral profile of multiple glutamatergic inputs to the nucleus accumbens. Neuron. 76 (4), 790-803, (2012).
- Kohl, M. M., Shipton, O. A., Deacon, R. M., Rawlins, J. N., Deisseroth, K., & Paulsen, O. Hemisphere-specific optogenetic stimulation reveals left-right asymmetry of hippocampal plasticity. Nat Neurosci. 14 (11), 1413-1415, (2011).
- Morozov, A., Sukato, D., & Ito, W. Selective suppression of plasticity in amygdala inputs from temporal association cortex by the external capsule. J Neurosci. 31 (1), 339-345, (2011).
- Davidson, B. L., & Breakefield, X. O. Viral vectors for gene delivery to the nervous system. Nat Rev Neurosci. 4 (5), 353-364, (2003).
- Aschauer, D. F., Kreuz, S., & Rumpel, S. Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain. PLoS One. 8 (9), e76310, (2013).
- Salegio, E. A. et al. Axonal transport of adeno-associated viral vectors is serotype-dependent. Gene Ther. 20 (3), 348-352, (2013).
- Holehonnur, R. et al. Adeno-associated viral serotypes produce differing titers and differentially transduce neurons within the rat basal and lateral amygdala. BMC Neurosci. 15, 28, (2014).
- McFarland, N. R., Lee, J. S., Hyman, B. T., & McLean, P. J. Comparison of transduction efficiency of recombinant AAV serotypes 1, 2, 5, and 8 in the rat nigrostriatal system. J Neurochem. 109 (3), 838-845, (2009).
- Miyashita, T., Shao, Y. R., Chung, J., Pourzia, O., & Feldman, D. E. Long-term channelrhodopsin-2 (ChR2) expression can induce abnormal axonal morphology and targeting in cerebral cortex. Front Neural Circuits. 7, 8, (2013).
