Ex Vivo optogenetic Dissection של מעגלי פחד פרוסות המוח
Summary
גישות optogenetic נמצאים בשימוש נרחב כדי לתפעל פעילות עצבית ולהעריך את ההשלכות על תפקוד המוח. הנה, טכניקה מתוארת שעם ביטוי in vivo של המפעיל האופטי Channelrhodopsin, המאפשר ניתוח vivo לשעבר של נכסים הסינפטי של ארוכי טווח ספציפי קשרים עצביים מקומיים מעגלים הקשורות פחד.
Abstract
גישות optogenetic נמצאים כעת בשימוש נרחב כדי ללמוד את הפונקציה של אוכלוסיות נוירונים ומעגלים ידי שילוב ביטוי ממוקד של חלבוני אור מופעל והמניפולציה הבאה של פעילות עצבית על ידי אור. Channelrhodopsins (ChRs) הם אור מגודר קטיון ערוצים וכאשר התמזגו חלבון פלואורסצנטי הביטוי שלהם מאפשר להדמית הפעלה בו זמנית של סוגי תאים ספציפיים תחזיות axonal שלהם באזורים המוגדרים של המוח. באמצעות זריקה stereotactic של וקטורים ויראליים, חלבונים היתוך CHR ניתן constitutively או הביע תנאי בתאים ספציפיים של אזור במוח מוגדר, ותחזיות axonal שלהם יכול לאחר מכן להיחקר אנטומית והן מבחינה תפקודית באמצעות לשעבר vivo ההפעלה optogenetic פרוסות המוח. זה הוא בעל חשיבות מיוחדת כאשר מכוונים על מנת להבין את המאפיינים הסינפטי של קשרים שלא ניתן להתמודד עם גישות גירוי קונבנציונליות חשמליות או בזיהוי affe רומןלהשכרה וקישוריות efferent כי הובן היטב בעבר. הנה, כמה דוגמאות להמחיש עד כמה טכניקה זו ניתן ליישם לחקור שאלות אלה כדי הבהרת מעגלים הקשורות פחד באמיגדלה. האמיגדלה היא אזור מפתח לרכישה והבעה של פחד, ואחסון של פחד זכרונות רגשיים. קווים של ראיות רבים מראים כי קליפת מוח הקדם חזיתית המדיאלי (mPFC) משתתפת היבטים שונים של רכישת פחד הכחדה, אבל הקישוריות המדויקת שלה עם האמיגדלה היא רק מתחילה להיות מובנת. ראשית, הוא הראה כיצד vivo לשעבר ההפעלה optogenetic יכול לשמש כדי לחקור היבטים של תקשורת הסינפטי בין afferents mPFC ותאי היעד באמיגדלה basolateral (BLA). יתר על כן, היא המחישה עד כמה vivo לשעבר זו הגישה optogenetic ניתן ליישם כדי להעריך דפוסי קישוריות הרומן באמצעות קבוצת נוירונים GABAergic באמיגדלה, האשכול תא intercalated paracapsular (mpITC), כדוגמה.
Introduction
כלים מדויקים להדמית הפעלה במקבילה של קשרים ספציפיים בין אזורים במוח לבין סוגים מסוימים של נוירונים הם הופכים חשובים יותר בהבנת מדינות תפקוד המוח ומחלות הבריאות הבסיסיות הקישוריות התפקודית. באופן אידיאלי, זה כרוך בחקירה פיזיולוגית של נכסים הסינפטי מדויקים עם אשר זיהו נוירונים לתקשר. זה נכון במיוחד עבור חיבורים בין אזורים במוח שלא ניתן להישמר פרוסה מוחית חריף יחידה. בעבר, זו הושגה בעיקר ניסויים נפרדים. מצד אחד, קליעים נותבים עצביים מוזרקים in vivo הועסק בשילוב עם אור עוקב או ניתוח מיקרוסקופי אלקטרונים של שותפים טרום postsynaptic. מצד השני, כאשר שטחי סיבים מהאזור מהמוצא נשמרים ונגישים בהכנת הפרוסה, גירוי חשמלי נעשה שימוש כדי להעריך מנגנוני תקשורת סינפטית עם תאים באזור היעד.
עם כניסתו של optogenetics, הביטוי הממוקד של-ערוצי קטיון אור המגודרים, כגון Channelrhodopsins (ChRs) התמזג חלבוני ניאון, מאפשר כעת הפעלה של נוירונים מסלולי axonal שלהם, ובמקביל לאפשר להדמיה שלהם פוסט הוק ניתוח אנטומי 1- 4. בגלל CHR להביע אקסונים יכול להיות מגורה גם כאשר ניתק מהורה somata 5, אפשר פרוסות המוח אל: 1) להעריך תשומות מאזורים במוח שלא היו נגישים עם גירוי חשמלי קונבנציונלי, כי שטחי סיבים אינם להפרדה או מסלול ספציפי הוא לא ידוע; 2) באופן חד משמעי לזהות את האזור המוצא לתשומות ספציפיות שהיו הניחו אך באופן חלקי הבינו; ו -3) לחקור את הקישוריות התפקודית בין סוגי תאים מוגדרים, הן מקומי והן בתחזיות ארוך טווח. בגלל מספר יתרונות, מיפוי optogenetic זו של מעגלים פרוסות המוח הפך רחבly בשימוש בשנים האחרונות, וכן מגוון של וקטורים ויראליים עבור ביטוי ChRs fluorescently-tagged זמין מספקי מסחרי. כמה יתרונות מרכזיים של הפעלת optogenetic על גירוי חשמלי קונבנציונלי הם ללא ניזק לרקמות עקב מיקום של אלקטרודות גירוי, ספציפי של גירוי סיבים כי גירוי חשמלי יכול גם לגייס סיבי מעבר או תאים סמוכים אחרים, וכן גירוי מהיר לא פחות ובזמן מדויק. בנוסף, הזרקת stereotactic של וקטורים ויראליים ניתן לכוון בקלות לאזורים ספציפיים במוח 6 וביטוי ספציפי מותנה או תאים מסוג יכול להיות מושגים באמצעות ביטוי Cre שונה ו / או מקדם 7 ספציפיים. הנה, טכניקה זו מיושמת למיפוי של ארוכי טווח ומעגלים מקומיים במערכת הפחד.
האמיגדלה היא אזור מפתח לרכישה והבעה של פחד, ואחסון של פחד זכרונות רגשיים 8,9. חוץ הלוך ושובמ האמיגדלה, קליפת המוח הקדם חזיתית המדיאלי (mPFC) ובהיפוקמפוס (HC), מבנים המחוברים באופן הדדי לאמיגדלה, הם מעורבים בהיבטים של הרכישה, איחוד ואחזור של זיכרונות פחד הכחדה 10,11. פעילות מחוזות של mPFC תנוגן תפקיד כפול זה לשלוט פחד גבוה ונמוך מקובעת 12,13. זה יכול בחלקו להיות מתווך על ידי קשרים ישירים מן mPFC לאמיגדלה שצפויה לשלוט פעילות האמיגדלה ופלט. לכן, בשנים האחרונות, מספר מחקרים אשר נכתבו בניסויים פרוסים vivo לשעבר לחקור אינטראקציות הסינפטי בין afferents mPFC ותאי יעד ספציפיים באמיגדלה 14-17.
במהלך הלמידה פחד, מידע חושי על גירויים ממוזגים מותנית מגיע האמיגדלה באמצעות תחזיות מאזורים התלמוס ואת קליפת המוח ספציפיים. פלסטיות של תשומות אלה לנוירונים בחלק לרוחב (LA) של basolהאמיגדלה ateral (BLA) היא מנגנון חשוב שבבסיס פחד מיזוג 9,18. ראיות הגדלה עולות כי תהליכי פלסטיק במקביל באמיגדלה כרוכות באלמנטים מעכבים לשלוט זיכרון פחד 19. קבוצת נוירונים מעכבים אשכולות הם תאי המדיאלי GABAergic intercalated paracapsular (mpITCs), אבל הקישוריות והתפקוד המדויקת שלהם מובנת 20-22 חלקית. כאן, מיפוי מעגל optogenetic משמש כדי להעריך קישוריות מביאה ו efferent של תאים אלה והשפיעו על הנוירונים היעד באמיגדלה, הוכחה כי mpITCs לקבל קלט חושי ישיר מתחנות ממסר התלמוס ואת קליפת מוח 23. ביטוי ספציפי של chr ב mpITCs או נוירונים BLA מאפשר מיפוי של אינטראקציות מקומיות, חושף כי mpITCs לעכב, אלא גם מופעלים הדדית, הנוירונים העיקריים BLA, הצבתם מעגלים מעכבות היזון קדימה ומשוב הרומן ששולטים ביעילות פעילות BLA23.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר שיטה לחקירת vivo לשעבר optogenetic של מעגלים עצביים וקישוריות מקומית שניתן ליישם בקלות על רוב, אם לא כל, setups ההקלטה תיקון- clamp הפרוס זקוף על ידי לאבזר אותם עם ננומטר ~ 470 LED בנמל אור epifluorescence. יתרון עיקרי של גירוי optogenetic של תחזיות axonal בפרוסה הוא שהיא מאפשרת ה…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Cora Hübner and Andrea Gall for help in acquiring some of the representative results. This work was supported by the Werner Reichardt Centre for Integrative Neuroscience (CIN) at the University of Tuebingen, an Excellence Initiative funded by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) within the framework of the Excellence Initiative (EXC 307), and by funds from the Charitable Hertie Foundation.
Materials
| Surgery | |||
| Stereotactic frame | Stoelting, USA | 51670 | can be replaced by other stereotactic frame for mice |
| Steretoxic frame mouse adaptor | Stoelting, USA | 51625 | |
| Gas anesthesia mask for mice | Stoelting, USA | 50264 | no longer available, replaced by item no. 51609M |
| Pressure injection device, Toohey Spritzer | Toohey Company, USA | T25-2-900 | other pressure injection devices (e.g. Picospritzer) can be used |
| Kwik Fill glass capillaries | World Precision Instruments, Germany | 1B150F-4 | |
| Anesthesia machine, IsoFlo | Eickemeyer, Germany | 213261 | |
| DC Temperature Controler and heating pad | FHC, USA | 40-90-8D | |
| Horizontal Micropipette Puller Model P-1000 | Sutter Instruments, USA | P-1000 | |
| Surgical tool sterilizer, Sterilizator 75 | Melag, Germany | 08754200 | |
| rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotype 2/9) | Penn Vector Core, USA | AV-9-26973P | |
| rAAV-CAGh-ChR2(H134R)-mCherry (serotype 2/9) | Penn Vector Core, USA | AV-9-20938M | |
| rAAV-EF1a-DIOhChR2(H134R)-YFP (serotype 2/1) | Penn Vector Core, USA | AV-1-20298P | |
| fast green | Roth, Germany | 0301.1 | |
| Isoflurane Anesthetic, Isofuran CP (1ml/ml) | CP Pharma, Germany | ||
| Antiseptic, Betadine (providone-iodine) | Purdure Products, USA | BSOL32 | can be replaced by other disinfectant |
| Analgesic, Metacam Solution (5mg/ml meloxicam) | Boehringer Ingelheim, Germany | can be replaced by other analgesics | |
| Bepanthen eye ointment | Bayer, Germany | 0191 | can be replaced by other eye ointment |
| Drill NM3000 (SNKG1341 and SNIH1681) | Nouvag, Switzerland | ||
| Sutranox Suture Needle | Fine Science Tools, Germany | 12050-01 | |
| Braided Silk Suture | Fine Science Tools, Germany | 18020-60 | |
| Recordings, light stimulation, and analysis | |||
| artificial cerebrospinal fluid (ACSF) | for composition see references #16 and #23 | ||
| internal patch solutions | for composition see references #16 and #23 | ||
| MagnesiumSulfate Heptahydrate | Roth, Germany | P027.1 | prepare 2M stock solution in purified water |
| Slicer, Microm HM650V | Fisher Scientific, Germany | 920120 | |
| Cooling unit for tissue slicer, CU65 | Fisher Scientific, Germany | 770180 | |
| Sapphire blade | Delaware Diamond Knives | custom order, inquire with company | |
| Stereoscope, SZX2-RFA16 | Olympus, Japan | ||
| Xcite fluorescent lamp (XI120Q-1492) | Lumen Dynamics Group, Canada | 2012-12699 | |
| Patch microscope, BX51WI | Olympus, Japan | ||
| Multiclamp 700B patch amplifier | Molecular Devices, USA | ||
| Digitdata 1440A | Molecular Devices, USA | ||
| PClamp software, Version 10 | Molecular Devices, USA | used to control data acquisition and stimulation | |
| Bath temperature controler, TC05 | Luigs & Neumann, Germany | 200-100 500 0145 | |
| Three axis micromanipulator Mini 25 | Luigs & Neumann, Germany | 210-100 000 0010 | |
| Micromanipulator controller SM7 | Luigs & Neumann, Germany | 200-100 900 7311 | |
| glass capillaries for patch pipettes | World Precision Instruments, Germany | GB150F-8P | |
| Cellulose nitrate filterpaper for interface chamber | Satorius Stedim Biotech, Germany | 13006–50—-ACN | |
| LED unit, CoolLED pE | CoolLED, UK | 244-1400 | CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation |
| CoolLED 100 Dual Adapt | CoolLED, UK | pE-ADAPTOR-50E | |
| LED unit, USL 70/470 | Rapp Optoelectronic | L70-000 | |
| Dual port adapter | Rapp Optoelectronic | inquire with company | |
| Filter set red (excitation) | AHF, Germany | F49-560 | Filters can be bought as set F46-008 |
| (beamsplitter) | AHF, Germany | F48-585 | |
| (emission) | AHF, Germany | F47-630 | |
| Filter set green (excitation) | AHF, Germany | F39-472 | Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission) |
| (beamsplitter) | AHF, Germany | F43-495W | |
| (emission) | AHF, Germany | F76-490 | |
| LaserCheck, handheld power meter | Coherent, USA | 1098293 | |
| IgorPro Software, Version 6 | Wavemetrics, USA | for electrophysiology data analysis, other alternative software packages can also be used | |
| Neuromatic suite of macros for IgorPro | http://www.neuromatic.thinkrandom.com | ||
| Post hoc analysis of injections and projections | |||
| Paraformaldehyde powder (PFA) | Roth, Germany | 0335.2 | |
| Neurotrace 435/455 blue fluorescent Nissl stain | Invitrogen | N-21479 | |
| agar-agar for embedding and resectioning | Roth, Germany | 5210.3 | |
| 30 x 10 mm petri dishes for embedding | SPL Life Sciences | alternatives can be used | |
| Slides, Super Frost | R. Langenbrinck, Germany | 61303802 | alternatives can be used |
| cover slips | R. Langenbrinck, Germany | 3000302 | alternatives can be used |
| Vecta Shield mounting medium | Vector Laboratories, USA | H-1000 | alternative mounting media can be used |
| cellulose nitrate filter for flattening slices for fixation | Satorius Stedim Biotech, Germany | 11406–25——N | |
| Confocal Laser Scanning Microscope LSM 710 | Zeiss, Germany | ||
Riferimenti
- Nagel, G. et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940-13945, (2003).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., & Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268, (2005).
- Tye, K. M., & Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nat Rev Neurosci. 13 (4), 251-266, (2012).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., & Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34, (2011).
- Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., & Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nat Neurosci. 10 (5), 663-668, (2007).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., & Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat Protoc. 1 (6), 3166-3173, (2006).
- Huang, Z. J., & Zeng, H. Genetic approaches to neural circuits in the mouse. Annu Rev Neurosci. 36, 183-215, (2013).
- LeDoux, J. E. Emotion circuits in the brain. Annu Rev Neurosci. 23, 155-184, (2000).
- Pape, H. C., & Pare, D. Plastic synaptic networks of the amygdala for the acquisition, expression, and extinction of conditioned fear. Physiol Rev. 90 (2), 419-463, (2010).
- Myers, K. M., & Davis, M. Mechanisms of fear extinction. Mol Psychiatry. 12 (2), 120-150, (2007).
- Quirk, G. J., & Mueller, D. Neural mechanisms of extinction learning and retrieval. Neuropsychopharmacology. 33 (1), 56-72, (2008).
- Vidal-Gonzalez, I., Vidal-Gonzalez, B., Rauch, S. L., & Quirk, G. J. Microstimulation reveals opposing influences of prelimbic and infralimbic cortex on the expression of conditioned fear. Learn Mem. 13 (6), 728-733, (2006).
- Sierra-Mercado, D., Padilla-Coreano, N., & Quirk, G. J. Dissociable roles of prelimbic and infralimbic cortices, ventral hippocampus, and basolateral amygdala in the expression and extinction of conditioned fear. Neuropsychopharmacology. 36 (2), 529-538, (2011).
- Cho, J. H., Deisseroth, K., & Bolshakov, V. Y. Synaptic encoding of fear extinction in mPFC-amygdala circuits. Neuron. 80 (6), 1491-1507, (2013).
- Arruda-Carvalho, M., & Clem, R. L. Pathway-Selective Adjustment of Prefrontal-Amygdala Transmission during Fear Encoding. J Neurosci. 34 (47), 15601-15609, (2014).
- Hubner, C., Bosch, D., Gall, A., Luthi, A., & Ehrlich, I. Ex vivo dissection of optogenetically activated mPFC and hippocampal inputs to neurons in the basolateral amygdala: implications for fear and emotional memory. Front Behav Neurosci. 8, 64, (2014).
- Strobel, C., Marek, R., Gooch, H. M., Sullivan, R. K., & Sah, P. Prefrontal and Auditory Input to Intercalated Neurons of the Amygdala. Cell Rep. 10 (9), 1435-1442, (2015).
- Sigurdsson, T., Doyere, V., Cain, C. K., & LeDoux, J. E. Long-term potentiation in the amygdala: a cellular mechanism of fear learning and memory. Neuropharmacology. 52 (1), 215-227, (2007).
- Ehrlich, I., Humeau, Y., Grenier, F., Ciocchi, S., Herry, C., & Luthi, A. Amygdala inhibitory circuits and the control of fear memory. Neuron. 62 (6), 757-771, (2009).
- Millhouse, O. E. The intercalated cells of the amygdala. J Comp Neurol. 247 (2), 246-271, (1986).
- Busti, D. et al. Different fear states engage distinct networks within the intercalated cell clusters of the amygdala. J Neurosci. 31 (13), 5131-5144, (2011).
- Palomares-Castillo, E., Hernandez-Perez, O. R., Perez-Carrera, D., Crespo-Ramirez, M., Fuxe, K., & Perez de la Mora, M. The intercalated paracapsular islands as a module for integration of signals regulating anxiety in the amygdala. Brain Res. 1476, 211-234, (2012).
- Asede, D., Bosch, D., Luthi, A., Ferraguti, F., & Ehrlich, I. Sensory inputs to intercalated cells provide fear-learning modulated inhibition to the basolateral amygdala. Neuron. 86 (2), 541-554, (2015).
- Tamamaki, N., Yanagawa, Y., Tomioka, R., Miyazaki, J., Obata, K., & Kaneko, T. Green fluorescent protein expression and colocalization with calretinin, parvalbumin, and somatostatin in the GAD67-GFP knock-in mouse. J Comp Neurol. 467 (1), 60-79, (2003).
- Mar, L., Yang, F. C., & Ma, Q. Genetic marking and characterization of Tac2-expressing neurons in the central and peripheral nervous system. Mol Brain. 5, 3, (2012).
- Jackman, S. L., Beneduce, B. M., Drew, I. R., & Regehr, W. G. Achieving high-frequency optical control of synaptic transmission. J Neurosci. 34 (22), 7704-7714, (2014).
- Li, H., Penzo, M. A., Taniguchi, H., Kopec, C. D., Huang, Z. J., & Li, B. Experience-dependent modification of a central amygdala fear circuit. Nat Neurosci. 16 (3), 332-339, (2013).
- Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., & Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457 (7233), 1142-1145, (2009).
- Felix-Ortiz, A. C., Beyeler, A., Seo, C., Leppla, C. A., Wildes, C. P., & Tye, K. M. BLA to vHPC inputs modulate anxiety-related behaviors. Neuron. 79 (4), 658-664, (2013).
- Chu, H. Y., Ito, W., Li, J., & Morozov, A. Target-specific suppression of GABA release from parvalbumin interneurons in the basolateral amygdala by dopamine. J Neurosci. 32 (42), 14815-14820, (2012).
- Zhang, Y. P., & Oertner, T. G. Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel. Nat Methods. 4 (2), 139-141, (2007).
- Britt, J. P., Benaliouad, F., McDevitt, R. A., Stuber, G. D., Wise, R. A., & Bonci, A. Synaptic and behavioral profile of multiple glutamatergic inputs to the nucleus accumbens. Neuron. 76 (4), 790-803, (2012).
- Kohl, M. M., Shipton, O. A., Deacon, R. M., Rawlins, J. N., Deisseroth, K., & Paulsen, O. Hemisphere-specific optogenetic stimulation reveals left-right asymmetry of hippocampal plasticity. Nat Neurosci. 14 (11), 1413-1415, (2011).
- Morozov, A., Sukato, D., & Ito, W. Selective suppression of plasticity in amygdala inputs from temporal association cortex by the external capsule. J Neurosci. 31 (1), 339-345, (2011).
- Davidson, B. L., & Breakefield, X. O. Viral vectors for gene delivery to the nervous system. Nat Rev Neurosci. 4 (5), 353-364, (2003).
- Aschauer, D. F., Kreuz, S., & Rumpel, S. Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain. PLoS One. 8 (9), e76310, (2013).
- Salegio, E. A. et al. Axonal transport of adeno-associated viral vectors is serotype-dependent. Gene Ther. 20 (3), 348-352, (2013).
- Holehonnur, R. et al. Adeno-associated viral serotypes produce differing titers and differentially transduce neurons within the rat basal and lateral amygdala. BMC Neurosci. 15, 28, (2014).
- McFarland, N. R., Lee, J. S., Hyman, B. T., & McLean, P. J. Comparison of transduction efficiency of recombinant AAV serotypes 1, 2, 5, and 8 in the rat nigrostriatal system. J Neurochem. 109 (3), 838-845, (2009).
- Miyashita, T., Shao, Y. R., Chung, J., Pourzia, O., & Feldman, D. E. Long-term channelrhodopsin-2 (ChR2) expression can induce abnormal axonal morphology and targeting in cerebral cortex. Front Neural Circuits. 7, 8, (2013).
