脳スライスにおける恐怖回路のex vivo光遺伝学解剖
Summary
光遺伝学アプローチは広く神経活動を操作し、脳機能の影響を評価するために使用されます。ここでは、この技術は、光活性化剤チャネルロドプシンのインビボでの発現の際に、恐怖に関連する回路内の特定の長距離およびローカル神経接続のシナプス特性のex vivo分析を可能にすることが概説されています。
Abstract
光遺伝学のアプローチは、現在広く光によって光活性化タンパク質と神経活動のその後の操作の標的発現を組み合わせることにより、神経集団や回路の機能を研究するために使用されています。 Channelrhodopsins（CHRS）は、光依存性カチオンチャネルであり、蛍光タンパク質に融合させたときに、それらの発現は、視覚化し、特定の細胞型の同時活性化と脳の定義された領域での軸索投射を可能にします。ウイルスベクターの定位注射によって、CHR融合タンパク質は、構成的にまたは条件規定された脳領域の特定の細胞で発現することができ、それらの軸索突起は、その後、脳切片におけるエクスビボ光遺伝学の活性化を介して、解剖学的及び機能的に研究することができます。従来の電気刺激の方法で対処することができなかった接続のシナプスの性質を理解することを目的とする場合に、または新規affeを識別する際に特に重要です以前に十分に理解された家賃と遠心性接続。ここでは、いくつかの例は、この技術が扁桃体に恐怖関連の回路の解明にこれらの質問を調査するために適用することができる方法を示しています。扁桃体は恐怖と感情的な思い出の取得と恐怖の表情、およびストレージのための重要な領域です。証拠の多くの行は、内側前頭前皮質（のmPFC）は恐怖の取得と絶滅のさまざまな側面に関与するが、扁桃体との正確な接続がちょうど理解され始めていることを示唆しています。まず、光遺伝学活性化は基底扁桃体（BLA）中のmPFCの求心性と標的細胞との間のシナプス伝達の側面を研究するために使用することができる方法をex vivoで示されています。また、このエクスビボ光遺伝学アプローチは、扁桃体においてGABA作動性ニューロンのグループを使用して新規の接続パターンを評価するために適用することができる方法を説明するが、一例としてparacapsularインターカレー細胞塊（mpITC）。
Introduction
可視化および脳領域および神経細胞の特定のタイプとの間の特定の接続の同時活性化のための正確なツールは、健康な脳機能及び疾患状態の根底にある機能的接続性を理解する上でより重要になってきています。理想的には、これは、ニューロンが通信識別される正確なシナプス特性の生理学的な調査を必要とします。これは、単一の急性脳スライスに保存することができない脳の領域間の接続に特に当てはまります。過去において、これは、主に別の実験で達成されました。一方、 生体内で注入された神経トレーサーは、後続の光や前およびシナプス後パートナーの電子顕微鏡分析と組み合わせて使用されてきました。原点の領域からの線維トラクトがスライス標本に保存し、アクセスされたとき一方、電気刺激は、標的領域内の細胞とシナプス通信メカニズムを評価するために使用されています。
彼らの可視化を可能にし、事後解剖学的分析の1-ながら、光遺伝学の出現により、蛍光タンパク質に融合したようなChannelrhodopsins（CHRS）などの光依存性陽イオンチャネルの標的発現は、今ニューロンとその軸索軌道の活性化を可能にします4。線維路が分離または特定の軌道ではないので、1）従来の電気刺激によるアクセスできませんでした脳領域からの入力を評価：親細胞体5から切断場合でもCHRを発現する軸索は刺激することができるので、それはに脳スライスで可能です不明です。 2）明確に想定するが完全には理解された特定の入力の出身地域を特定します。そして、3）の両方のローカルおよび長距離の突起で、定義された細胞型の間の機能の接続性を調べます。そのため、多くの利点を、脳スライス内の回路のこの光遺伝学マッピングは、ワイドになっていますlyが最後の年で使用され、蛍光タグ付きCHRSの発現のための種々のウイルスベクターは、商業的な供給業者から容易に入手可能です。電気刺激はまた、通路または他の近くの細胞、および均等に迅速かつ時間的に正確な刺激の繊維を募集する可能性があるため、従来の電気刺激を超える光遺伝学活性化のいくつかの重要な利点は、刺激電極の配置、繊維の刺激の特異性に起因する組織への損傷はありません。さらに、ウイルスベクターの定位注射を容易Cre依存の発現および/ または特異的プロモーター7を用いて達成することができる特定の脳領域6及び条件または細胞型特異的発現を標的とすることができます。ここでは、この技術は、恐怖システムにおける長距離のマッピングとローカル回路に印加されます。
扁桃体は恐怖と感情的な思い出8,9の取得と恐怖の表情、およびストレージのための重要な領域です。別にあちこち扁桃体、内側前頭前皮質（のmPFC）および海馬（HC）のmは、相互に扁桃体に接続されている構造は、恐怖や絶滅思い出10,11の買収、統合と検索の側面に関与しています。 mPFCの細分化における活性は12,13を述べてハイとローの両方の恐怖を制御する際に二重の役割を果たしていると思われます。これは、一部には扁桃体の活動と出力を制御することになる扁桃体へのmPFCからの直接接続によって媒介される可能性があります。そのため、最後の年に、いくつかの研究では、扁桃体14-17でのmPFCの求心性および特定の標的細胞間のシナプスの相互作用を調査するためにex vivoでスライス実験で始まりました。
恐怖学習中は、エアコンと無条件刺激についての感覚情報は、特定の視床と皮質領域からの突起を介して、扁桃体に到達します。 basolの側部（LA）内のニューロンへのこれらの入力の可塑性ateral扁桃体（BLA）が恐怖条件9,18の基礎となる重要なメカニズムです。増加する証拠は、扁桃体における並列プラスチックプロセスが恐怖記憶19を制御するための阻害要素を伴うことを示唆しています。クラスタ化された抑制性ニューロンのグループは、GABA作動性内側paracapsularインターカレーション細胞（mpITCs）であるが、その正確な接続性と機能が不完全20-22を理解されています。ここでは、光遺伝学の回路マッピングはmpITCsは視床と皮質中継局23からの直接の感覚入力を受け取ることを実証し、求心性および遠心性これらの細胞の接続と扁桃体における標的ニューロンへの影響を評価するために使用されます。 mpITCsまたはBLAニューロンにおけるCHRの特異的な発現を効果的BLAの活性を制御新規フィードフォワードとフィードバック抑制回路に置く、mpITCsを阻害することを明らかにし、局所的相互作用のマッピングを可能にするだけでなく、相互にBLA校長ニューロン、によって活性化されます23。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、すべてではない簡単に、最も上に実装することができ、神経回路やローカル接続のex vivo光遺伝学調査のための方法を説明し、落射蛍光光ポートのLED〜470 nmのとそれらを装備することにより、直立スライスパッチクランプ記録のセットアップ。スライスにおける軸索突起の光遺伝学刺激の主な利点は、対応する線維路が明確に定義されていない、またはに保存されな…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Cora Hübner and Andrea Gall for help in acquiring some of the representative results. This work was supported by the Werner Reichardt Centre for Integrative Neuroscience (CIN) at the University of Tuebingen, an Excellence Initiative funded by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) within the framework of the Excellence Initiative (EXC 307), and by funds from the Charitable Hertie Foundation.
Materials
| Surgery | |||
| Stereotactic frame | Stoelting, USA | 51670 | can be replaced by other stereotactic frame for mice |
| Steretoxic frame mouse adaptor | Stoelting, USA | 51625 | |
| Gas anesthesia mask for mice | Stoelting, USA | 50264 | no longer available, replaced by item no. 51609M |
| Pressure injection device, Toohey Spritzer | Toohey Company, USA | T25-2-900 | other pressure injection devices (e.g. Picospritzer) can be used |
| Kwik Fill glass capillaries | World Precision Instruments, Germany | 1B150F-4 | |
| Anesthesia machine, IsoFlo | Eickemeyer, Germany | 213261 | |
| DC Temperature Controler and heating pad | FHC, USA | 40-90-8D | |
| Horizontal Micropipette Puller Model P-1000 | Sutter Instruments, USA | P-1000 | |
| Surgical tool sterilizer, Sterilizator 75 | Melag, Germany | 08754200 | |
| rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotype 2/9) | Penn Vector Core, USA | AV-9-26973P | |
| rAAV-CAGh-ChR2(H134R)-mCherry (serotype 2/9) | Penn Vector Core, USA | AV-9-20938M | |
| rAAV-EF1a-DIOhChR2(H134R)-YFP (serotype 2/1) | Penn Vector Core, USA | AV-1-20298P | |
| fast green | Roth, Germany | 0301.1 | |
| Isoflurane Anesthetic, Isofuran CP (1ml/ml) | CP Pharma, Germany | ||
| Antiseptic, Betadine (providone-iodine) | Purdure Products, USA | BSOL32 | can be replaced by other disinfectant |
| Analgesic, Metacam Solution (5mg/ml meloxicam) | Boehringer Ingelheim, Germany | can be replaced by other analgesics | |
| Bepanthen eye ointment | Bayer, Germany | 0191 | can be replaced by other eye ointment |
| Drill NM3000 (SNKG1341 and SNIH1681) | Nouvag, Switzerland | ||
| Sutranox Suture Needle | Fine Science Tools, Germany | 12050-01 | |
| Braided Silk Suture | Fine Science Tools, Germany | 18020-60 | |
| Recordings, light stimulation, and analysis | |||
| artificial cerebrospinal fluid (ACSF) | for composition see references #16 and #23 | ||
| internal patch solutions | for composition see references #16 and #23 | ||
| MagnesiumSulfate Heptahydrate | Roth, Germany | P027.1 | prepare 2M stock solution in purified water |
| Slicer, Microm HM650V | Fisher Scientific, Germany | 920120 | |
| Cooling unit for tissue slicer, CU65 | Fisher Scientific, Germany | 770180 | |
| Sapphire blade | Delaware Diamond Knives | custom order, inquire with company | |
| Stereoscope, SZX2-RFA16 | Olympus, Japan | ||
| Xcite fluorescent lamp (XI120Q-1492) | Lumen Dynamics Group, Canada | 2012-12699 | |
| Patch microscope, BX51WI | Olympus, Japan | ||
| Multiclamp 700B patch amplifier | Molecular Devices, USA | ||
| Digitdata 1440A | Molecular Devices, USA | ||
| PClamp software, Version 10 | Molecular Devices, USA | used to control data acquisition and stimulation | |
| Bath temperature controler, TC05 | Luigs & Neumann, Germany | 200-100 500 0145 | |
| Three axis micromanipulator Mini 25 | Luigs & Neumann, Germany | 210-100 000 0010 | |
| Micromanipulator controller SM7 | Luigs & Neumann, Germany | 200-100 900 7311 | |
| glass capillaries for patch pipettes | World Precision Instruments, Germany | GB150F-8P | |
| Cellulose nitrate filterpaper for interface chamber | Satorius Stedim Biotech, Germany | 13006–50—-ACN | |
| LED unit, CoolLED pE | CoolLED, UK | 244-1400 | CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation |
| CoolLED 100 Dual Adapt | CoolLED, UK | pE-ADAPTOR-50E | |
| LED unit, USL 70/470 | Rapp Optoelectronic | L70-000 | |
| Dual port adapter | Rapp Optoelectronic | inquire with company | |
| Filter set red (excitation) | AHF, Germany | F49-560 | Filters can be bought as set F46-008 |
| (beamsplitter) | AHF, Germany | F48-585 | |
| (emission) | AHF, Germany | F47-630 | |
| Filter set green (excitation) | AHF, Germany | F39-472 | Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission) |
| (beamsplitter) | AHF, Germany | F43-495W | |
| (emission) | AHF, Germany | F76-490 | |
| LaserCheck, handheld power meter | Coherent, USA | 1098293 | |
| IgorPro Software, Version 6 | Wavemetrics, USA | for electrophysiology data analysis, other alternative software packages can also be used | |
| Neuromatic suite of macros for IgorPro | http://www.neuromatic.thinkrandom.com | ||
| Post hoc analysis of injections and projections | |||
| Paraformaldehyde powder (PFA) | Roth, Germany | 0335.2 | |
| Neurotrace 435/455 blue fluorescent Nissl stain | Invitrogen | N-21479 | |
| agar-agar for embedding and resectioning | Roth, Germany | 5210.3 | |
| 30 x 10 mm petri dishes for embedding | SPL Life Sciences | alternatives can be used | |
| Slides, Super Frost | R. Langenbrinck, Germany | 61303802 | alternatives can be used |
| cover slips | R. Langenbrinck, Germany | 3000302 | alternatives can be used |
| Vecta Shield mounting medium | Vector Laboratories, USA | H-1000 | alternative mounting media can be used |
| cellulose nitrate filter for flattening slices for fixation | Satorius Stedim Biotech, Germany | 11406–25——N | |
| Confocal Laser Scanning Microscope LSM 710 | Zeiss, Germany | ||
Riferimenti
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