Ex Vivo optogenetic Disseksjon av Fear kretser i hjernen skiver
Summary
Optogenetic tilnærminger er mye brukt for å manipulere nevral aktivitet og vurdere konsekvenser for hjernefunksjonen. Her blir en teknikk skissert som ved in vivo-ekspresjon av det optiske aktivator Channelrhodopsin, gjør det mulig for ex vivo analyse av synaptiske egenskaper av spesifikk lang rekkevidde og lokale nerveforbindelser i frykt-relaterte kretser.
Abstract
Optogenetic tilnærminger er nå mye brukt for å studere funksjonen av nevrale populasjoner og kretser ved å kombinere målrettet ekspresjon av lys-aktiverte proteiner og påfølgende manipulering av nevral aktivitet av lys. Channelrhodopsins (CHRS) er lys-gated kation-kanaler, og da kondensert til en fluorescent protein deres ekspresjon tillater visualisering og samtidig aktivering av spesifikke celletyper og deres aksonale projeksjoner i definerte områder av hjernen. Via stereotaktisk injeksjon av virale vektorer, kan Chr fusjonsproteiner bli konstitutivt eller betinget uttrykt i bestemte celler i et definert hjernen regionen, og deres aksonale projeksjoner kan senere bli studert anatomisk og funksjonelt via ex vivo optogenetic aktivering i hjernen skiver. Dette er spesielt viktig når som mål å forstå synaptiske egenskaper av forbindelser som ikke kunne løses med konvensjonelle elektriske stimulerings tilnærminger, eller i å identifisere roman affeleie og efferente tilkobling som tidligere dårlig forstått. Her noen eksempler illustrerer hvordan denne teknikken kan brukes til å undersøke disse spørsmålene til å belyse frykt-relaterte kretser i amygdala. Amygdala er en viktig region for kjøp og uttrykk for frykt, og lagring av frykt og emosjonelle minner. Mange linjer av bevis tyder på at den mediale prefrontale cortex (MPFC) deltar i ulike aspekter av frykt oppkjøp og utryddelse, men dens presise tilkobling med amygdala er akkurat begynt å bli forstått. For det første er det vist hvordan ex vivo optogenetic aktivering kan brukes til å studere aspekter av synaptisk kommunikasjon mellom MPFC afferente og målceller i basolateral amygdala (BLA). Videre er det illustrert hvordan dette ex vivo optogenetic tilnærmingen kan brukes til å vurdere nye tilkoblings mønstre ved hjelp av en gruppe av GABAergiske neuroner i amygdala, den paracapsular interkalert celleklase (mpITC), som et eksempel.
Introduction
Presise verktøy for visualisering og samtidig aktivering av spesifikke forbindelser mellom hjerneområder og spesifikke typer nerveceller blir mer viktig for å forstå de funksjonelle tilkoblingsunderliggende friske hjernens funksjon og sykdomstilstander. Ideelt sett innebærer dette fysiologiske undersøkelser av presise synaptiske egenskaper som er identifisert nerveceller kommuniserer. Dette gjelder særlig for forbindelser mellom hjerneområder som ikke kan ivaretas i en enkelt akutt hjerne skive. I det siste har dette blitt oppnådd i stor grad i separate forsøk. På den ene siden, neural tracere injiseres in vivo er blitt anvendt i kombinasjon med etterfølgende lys eller elektronmikroskopanalyse av pre- og postsynaptisk partnere. På den annen side, når fiber traktene fra regionen opprinnelse er bevart og er tilgjengelige under fremstillingen skive, elektrisk stimulering har vært brukt for å vurdere synaptiske mekanismer kommunikasjon med celler i målområdet.
Med bruk av optogenetics, målrettet uttrykk for lys-gated sjons-kanaler, for eksempel Channelrhodopsins (CHRS) smeltet til fluorescerende proteiner gjør nå aktivering av nevroner og deres aksonal baner samtidig som for sin visualisering og post-hoc anatomisk analyse 1- 4. Fordi CHR-uttrykk axoner kan stimuleres selv når skilt fra moder somata 5, er det mulig i hjerneskiver til: 1) å vurdere innganger fra hjerneområdet som ikke var tilgjengelig med vanlig elektrisk stimulering, fordi fiberkanalen ikke er separerbare eller den bestemte bane er ikke kjent; 2) utvetydig identifiserer regionen er utstedt på bestemte innganger som ble postulert men ufullstendig forstått; og 3) undersøke den funksjonelle tilkobling mellom definerte celletyper, både lokalt og i langtrekkende anslag. På grunn av en rekke fordeler, har denne optogenetic kartlegging av kretser i hjerneskiver blir bredly anvendt i de siste år, og en rekke virale vektorer for ekspresjon av fluorescently-merket CHRS er lett tilgjengelige fra kommersielle leverandører. Noen viktige fordeler med optogenetic aktivering over konvensjonelle elektrisk stimulering er ingen skade på vev på grunn av plassering av stimuleringselektroder, spesifisitet av fiber stimulering fordi elektrisk stimulering kan også rekruttere fibre av passasje eller andre nærliggende celler, og en like rask og timelig presis stimulering. I tillegg kan stereotaktisk injeksjon av virale vektorer lett bli målrettet til spesifikke hjerneområder 6 og betinget eller celletype-spesifikk ekspresjon kan oppnås ved hjelp av Cre-avhengig ekspresjon og / eller mer spesifikke aktivatorer 7. Her er denne teknikken brukes for kartlegging av langtrekkende og lokale kretser i frykt systemet.
Amygdala er en viktig region for kjøp og uttrykk for frykt, og lagring av frykt og emosjonelle minner 8,9. bortsett from amygdala, den mediale prefrontale cortex (MPFC) og hippocampus (HC), strukturer som er gjensidig knyttet til amygdala, er innblandet i aspekter av oppkjøp, konsolidering og gjenfinning av frykt og utryddelse minner 10,11. Aktivitet i underinndelinger av MPFC ser ut til å spille en dobbelt rolle i å kontrollere både høy og lav frykt fastslår 12,13. Dette kan delvis være mediert av direkte forbindelser fra MPFC til amygdala som ville kontrollere amygdala aktivitet og produksjon. Derfor, i de siste årene har flere studier startet i ex vivo slice eksperimenter for å undersøke synaptiske interaksjoner mellom MPFC afferente og bestemte målceller i amygdala 14-17.
Under frykt læring, sensorisk informasjon om betinget og ubetinget stimuli når amygdala via anslag fra bestemte thalamic og kortikale regioner. Plastisitet av disse inngangene til neuroner i sidedelen (LA) av Basolateral amygdala (BLA) er en viktig mekanisme underliggende frykt condition 9,18. Økende bevis tyder på at parallelle plast prosesser i amygdala involvere hemmende elementer for å kontrollere frykt minne 19. En gruppe av grupperte hemmende nerveceller er gabaergic mediale paracapsular Pilgrim celler (mpITCs), men deres nøyaktige tilkobling og funksjon er ufullstendig forstått 20-22. Her er optogenetic krets kartlegging brukes til å vurdere afferent og efferent tilkobling av disse cellene og deres innvirkning på målet nevroner i amygdala, som viser at mpITCs motta direkte sanseinntrykk fra thalamic og kortikale relé stasjoner 23. Spesifikk uttrykk for Chr i mpITCs eller BLA nevroner tillater kartlegging av lokale interaksjoner, avsløre at mpITCs hemme, men er også aktivert gjensidig av, BLA viktigste nevroner, plassere dem i nye feed-forward og tilbakemeldinger hemmende kretser som effektivt kontrollerer BLA aktivitet23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen beskriver en metode for ex vivo optogenetic undersøkelse av nevrale kretser og lokal tilkobling som enkelt kan implementeres på de fleste, om ikke alle, oppreist slice patch-clamp opptak oppsett ved å utstyre dem med en ~ 470 nm LED ved epifluorescence lys port. En stor fordel med optogenetic stimulering av aksonal anslagene i skiver er at det gir mulighet for spesifikk aktivering og undersøkelse av egenskapene til forbindelser som ikke var tilgjengelig med konvensjonell elektrisk stimuler…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Cora Hübner and Andrea Gall for help in acquiring some of the representative results. This work was supported by the Werner Reichardt Centre for Integrative Neuroscience (CIN) at the University of Tuebingen, an Excellence Initiative funded by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) within the framework of the Excellence Initiative (EXC 307), and by funds from the Charitable Hertie Foundation.
Materials
| Surgery | |||
| Stereotactic frame | Stoelting, USA | 51670 | can be replaced by other stereotactic frame for mice |
| Steretoxic frame mouse adaptor | Stoelting, USA | 51625 | |
| Gas anesthesia mask for mice | Stoelting, USA | 50264 | no longer available, replaced by item no. 51609M |
| Pressure injection device, Toohey Spritzer | Toohey Company, USA | T25-2-900 | other pressure injection devices (e.g. Picospritzer) can be used |
| Kwik Fill glass capillaries | World Precision Instruments, Germany | 1B150F-4 | |
| Anesthesia machine, IsoFlo | Eickemeyer, Germany | 213261 | |
| DC Temperature Controler and heating pad | FHC, USA | 40-90-8D | |
| Horizontal Micropipette Puller Model P-1000 | Sutter Instruments, USA | P-1000 | |
| Surgical tool sterilizer, Sterilizator 75 | Melag, Germany | 08754200 | |
| rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotype 2/9) | Penn Vector Core, USA | AV-9-26973P | |
| rAAV-CAGh-ChR2(H134R)-mCherry (serotype 2/9) | Penn Vector Core, USA | AV-9-20938M | |
| rAAV-EF1a-DIOhChR2(H134R)-YFP (serotype 2/1) | Penn Vector Core, USA | AV-1-20298P | |
| fast green | Roth, Germany | 0301.1 | |
| Isoflurane Anesthetic, Isofuran CP (1ml/ml) | CP Pharma, Germany | ||
| Antiseptic, Betadine (providone-iodine) | Purdure Products, USA | BSOL32 | can be replaced by other disinfectant |
| Analgesic, Metacam Solution (5mg/ml meloxicam) | Boehringer Ingelheim, Germany | can be replaced by other analgesics | |
| Bepanthen eye ointment | Bayer, Germany | 0191 | can be replaced by other eye ointment |
| Drill NM3000 (SNKG1341 and SNIH1681) | Nouvag, Switzerland | ||
| Sutranox Suture Needle | Fine Science Tools, Germany | 12050-01 | |
| Braided Silk Suture | Fine Science Tools, Germany | 18020-60 | |
| Recordings, light stimulation, and analysis | |||
| artificial cerebrospinal fluid (ACSF) | for composition see references #16 and #23 | ||
| internal patch solutions | for composition see references #16 and #23 | ||
| MagnesiumSulfate Heptahydrate | Roth, Germany | P027.1 | prepare 2M stock solution in purified water |
| Slicer, Microm HM650V | Fisher Scientific, Germany | 920120 | |
| Cooling unit for tissue slicer, CU65 | Fisher Scientific, Germany | 770180 | |
| Sapphire blade | Delaware Diamond Knives | custom order, inquire with company | |
| Stereoscope, SZX2-RFA16 | Olympus, Japan | ||
| Xcite fluorescent lamp (XI120Q-1492) | Lumen Dynamics Group, Canada | 2012-12699 | |
| Patch microscope, BX51WI | Olympus, Japan | ||
| Multiclamp 700B patch amplifier | Molecular Devices, USA | ||
| Digitdata 1440A | Molecular Devices, USA | ||
| PClamp software, Version 10 | Molecular Devices, USA | used to control data acquisition and stimulation | |
| Bath temperature controler, TC05 | Luigs & Neumann, Germany | 200-100 500 0145 | |
| Three axis micromanipulator Mini 25 | Luigs & Neumann, Germany | 210-100 000 0010 | |
| Micromanipulator controller SM7 | Luigs & Neumann, Germany | 200-100 900 7311 | |
| glass capillaries for patch pipettes | World Precision Instruments, Germany | GB150F-8P | |
| Cellulose nitrate filterpaper for interface chamber | Satorius Stedim Biotech, Germany | 13006–50—-ACN | |
| LED unit, CoolLED pE | CoolLED, UK | 244-1400 | CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation |
| CoolLED 100 Dual Adapt | CoolLED, UK | pE-ADAPTOR-50E | |
| LED unit, USL 70/470 | Rapp Optoelectronic | L70-000 | |
| Dual port adapter | Rapp Optoelectronic | inquire with company | |
| Filter set red (excitation) | AHF, Germany | F49-560 | Filters can be bought as set F46-008 |
| (beamsplitter) | AHF, Germany | F48-585 | |
| (emission) | AHF, Germany | F47-630 | |
| Filter set green (excitation) | AHF, Germany | F39-472 | Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission) |
| (beamsplitter) | AHF, Germany | F43-495W | |
| (emission) | AHF, Germany | F76-490 | |
| LaserCheck, handheld power meter | Coherent, USA | 1098293 | |
| IgorPro Software, Version 6 | Wavemetrics, USA | for electrophysiology data analysis, other alternative software packages can also be used | |
| Neuromatic suite of macros for IgorPro | http://www.neuromatic.thinkrandom.com | ||
| Post hoc analysis of injections and projections | |||
| Paraformaldehyde powder (PFA) | Roth, Germany | 0335.2 | |
| Neurotrace 435/455 blue fluorescent Nissl stain | Invitrogen | N-21479 | |
| agar-agar for embedding and resectioning | Roth, Germany | 5210.3 | |
| 30 x 10 mm petri dishes for embedding | SPL Life Sciences | alternatives can be used | |
| Slides, Super Frost | R. Langenbrinck, Germany | 61303802 | alternatives can be used |
| cover slips | R. Langenbrinck, Germany | 3000302 | alternatives can be used |
| Vecta Shield mounting medium | Vector Laboratories, USA | H-1000 | alternative mounting media can be used |
| cellulose nitrate filter for flattening slices for fixation | Satorius Stedim Biotech, Germany | 11406–25——N | |
| Confocal Laser Scanning Microscope LSM 710 | Zeiss, Germany | ||
Riferimenti
- Nagel, G. et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940-13945, (2003).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., & Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268, (2005).
- Tye, K. M., & Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nat Rev Neurosci. 13 (4), 251-266, (2012).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., & Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34, (2011).
- Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., & Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nat Neurosci. 10 (5), 663-668, (2007).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., & Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat Protoc. 1 (6), 3166-3173, (2006).
- Huang, Z. J., & Zeng, H. Genetic approaches to neural circuits in the mouse. Annu Rev Neurosci. 36, 183-215, (2013).
- LeDoux, J. E. Emotion circuits in the brain. Annu Rev Neurosci. 23, 155-184, (2000).
- Pape, H. C., & Pare, D. Plastic synaptic networks of the amygdala for the acquisition, expression, and extinction of conditioned fear. Physiol Rev. 90 (2), 419-463, (2010).
- Myers, K. M., & Davis, M. Mechanisms of fear extinction. Mol Psychiatry. 12 (2), 120-150, (2007).
- Quirk, G. J., & Mueller, D. Neural mechanisms of extinction learning and retrieval. Neuropsychopharmacology. 33 (1), 56-72, (2008).
- Vidal-Gonzalez, I., Vidal-Gonzalez, B., Rauch, S. L., & Quirk, G. J. Microstimulation reveals opposing influences of prelimbic and infralimbic cortex on the expression of conditioned fear. Learn Mem. 13 (6), 728-733, (2006).
- Sierra-Mercado, D., Padilla-Coreano, N., & Quirk, G. J. Dissociable roles of prelimbic and infralimbic cortices, ventral hippocampus, and basolateral amygdala in the expression and extinction of conditioned fear. Neuropsychopharmacology. 36 (2), 529-538, (2011).
- Cho, J. H., Deisseroth, K., & Bolshakov, V. Y. Synaptic encoding of fear extinction in mPFC-amygdala circuits. Neuron. 80 (6), 1491-1507, (2013).
- Arruda-Carvalho, M., & Clem, R. L. Pathway-Selective Adjustment of Prefrontal-Amygdala Transmission during Fear Encoding. J Neurosci. 34 (47), 15601-15609, (2014).
- Hubner, C., Bosch, D., Gall, A., Luthi, A., & Ehrlich, I. Ex vivo dissection of optogenetically activated mPFC and hippocampal inputs to neurons in the basolateral amygdala: implications for fear and emotional memory. Front Behav Neurosci. 8, 64, (2014).
- Strobel, C., Marek, R., Gooch, H. M., Sullivan, R. K., & Sah, P. Prefrontal and Auditory Input to Intercalated Neurons of the Amygdala. Cell Rep. 10 (9), 1435-1442, (2015).
- Sigurdsson, T., Doyere, V., Cain, C. K., & LeDoux, J. E. Long-term potentiation in the amygdala: a cellular mechanism of fear learning and memory. Neuropharmacology. 52 (1), 215-227, (2007).
- Ehrlich, I., Humeau, Y., Grenier, F., Ciocchi, S., Herry, C., & Luthi, A. Amygdala inhibitory circuits and the control of fear memory. Neuron. 62 (6), 757-771, (2009).
- Millhouse, O. E. The intercalated cells of the amygdala. J Comp Neurol. 247 (2), 246-271, (1986).
- Busti, D. et al. Different fear states engage distinct networks within the intercalated cell clusters of the amygdala. J Neurosci. 31 (13), 5131-5144, (2011).
- Palomares-Castillo, E., Hernandez-Perez, O. R., Perez-Carrera, D., Crespo-Ramirez, M., Fuxe, K., & Perez de la Mora, M. The intercalated paracapsular islands as a module for integration of signals regulating anxiety in the amygdala. Brain Res. 1476, 211-234, (2012).
- Asede, D., Bosch, D., Luthi, A., Ferraguti, F., & Ehrlich, I. Sensory inputs to intercalated cells provide fear-learning modulated inhibition to the basolateral amygdala. Neuron. 86 (2), 541-554, (2015).
- Tamamaki, N., Yanagawa, Y., Tomioka, R., Miyazaki, J., Obata, K., & Kaneko, T. Green fluorescent protein expression and colocalization with calretinin, parvalbumin, and somatostatin in the GAD67-GFP knock-in mouse. J Comp Neurol. 467 (1), 60-79, (2003).
- Mar, L., Yang, F. C., & Ma, Q. Genetic marking and characterization of Tac2-expressing neurons in the central and peripheral nervous system. Mol Brain. 5, 3, (2012).
- Jackman, S. L., Beneduce, B. M., Drew, I. R., & Regehr, W. G. Achieving high-frequency optical control of synaptic transmission. J Neurosci. 34 (22), 7704-7714, (2014).
- Li, H., Penzo, M. A., Taniguchi, H., Kopec, C. D., Huang, Z. J., & Li, B. Experience-dependent modification of a central amygdala fear circuit. Nat Neurosci. 16 (3), 332-339, (2013).
- Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., & Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457 (7233), 1142-1145, (2009).
- Felix-Ortiz, A. C., Beyeler, A., Seo, C., Leppla, C. A., Wildes, C. P., & Tye, K. M. BLA to vHPC inputs modulate anxiety-related behaviors. Neuron. 79 (4), 658-664, (2013).
- Chu, H. Y., Ito, W., Li, J., & Morozov, A. Target-specific suppression of GABA release from parvalbumin interneurons in the basolateral amygdala by dopamine. J Neurosci. 32 (42), 14815-14820, (2012).
- Zhang, Y. P., & Oertner, T. G. Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel. Nat Methods. 4 (2), 139-141, (2007).
- Britt, J. P., Benaliouad, F., McDevitt, R. A., Stuber, G. D., Wise, R. A., & Bonci, A. Synaptic and behavioral profile of multiple glutamatergic inputs to the nucleus accumbens. Neuron. 76 (4), 790-803, (2012).
- Kohl, M. M., Shipton, O. A., Deacon, R. M., Rawlins, J. N., Deisseroth, K., & Paulsen, O. Hemisphere-specific optogenetic stimulation reveals left-right asymmetry of hippocampal plasticity. Nat Neurosci. 14 (11), 1413-1415, (2011).
- Morozov, A., Sukato, D., & Ito, W. Selective suppression of plasticity in amygdala inputs from temporal association cortex by the external capsule. J Neurosci. 31 (1), 339-345, (2011).
- Davidson, B. L., & Breakefield, X. O. Viral vectors for gene delivery to the nervous system. Nat Rev Neurosci. 4 (5), 353-364, (2003).
- Aschauer, D. F., Kreuz, S., & Rumpel, S. Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain. PLoS One. 8 (9), e76310, (2013).
- Salegio, E. A. et al. Axonal transport of adeno-associated viral vectors is serotype-dependent. Gene Ther. 20 (3), 348-352, (2013).
- Holehonnur, R. et al. Adeno-associated viral serotypes produce differing titers and differentially transduce neurons within the rat basal and lateral amygdala. BMC Neurosci. 15, 28, (2014).
- McFarland, N. R., Lee, J. S., Hyman, B. T., & McLean, P. J. Comparison of transduction efficiency of recombinant AAV serotypes 1, 2, 5, and 8 in the rat nigrostriatal system. J Neurochem. 109 (3), 838-845, (2009).
- Miyashita, T., Shao, Y. R., Chung, J., Pourzia, O., & Feldman, D. E. Long-term channelrhodopsin-2 (ChR2) expression can induce abnormal axonal morphology and targeting in cerebral cortex. Front Neural Circuits. 7, 8, (2013).
