Ex Vivo Optogenética Disección de circuitos del miedo en rodajas de cerebro
Summary
enfoques Optogenética son ampliamente utilizados para manipular la actividad neuronal y evaluar las consecuencias para la función cerebral. Aquí, una técnica que se describe después de la expresión in vivo del activador óptico canalrodopsina, permite el análisis ex vivo de las propiedades sinápticas de largo alcance específico y conexiones neuronales locales en los circuitos relacionados con el miedo.
Abstract
enfoques Optogenética son ampliamente utilizados para estudiar la función de las poblaciones neuronales y los circuitos mediante la combinación de la expresión específica de proteínas activadas por la luz y la posterior manipulación de la actividad neural por la luz. Channelrhodopsins (CHRS) son cationes canales de luz cerrada y cuando se fusiona a una proteína fluorescente su expresión permite la visualización y la activación simultánea de los tipos de células específicas y sus proyecciones axonales en áreas definidas del cerebro. Via inyección estereotáctica de vectores virales, proteínas de fusión CHR pueden ser constitutivamente o condicionalmente expresan en células específicas de una región del cerebro definido, y sus proyecciones axonales posteriormente se pueden estudiar anatómica y funcionalmente a través de la activación ex vivo optogenético en rodajas de cerebro. Esto es de particular importancia cuando el objetivo de comprender las propiedades sinápticas de conexiones que no pueden ser tratados con los enfoques convencionales de estimulación eléctrica, o en la identificación de nuevos affealquiler y conectividad eferentes que fue previamente poco conocida. Aquí, algunos ejemplos ilustran cómo esta técnica se puede aplicar a investigar estas preguntas a la aclaración de los circuitos relacionados con el miedo en la amígdala. La amígdala es una región clave para la adquisición y expresión de miedo, y el almacenamiento de miedo y recuerdos emocionales. Muchas líneas de evidencia sugieren que la corteza prefrontal medial (córtex prefrontal medial) participa en diferentes aspectos de la adquisición del miedo y la extinción, pero su conectividad preciso con la amígdala está empezando a ser entendido. En primer lugar, se muestra cómo la activación ex vivo optogenético se puede utilizar para estudiar aspectos de la comunicación sináptica entre los aferentes mPFC y células diana en la amígdala basolateral (BLA). Además, se ilustra cómo este enfoque ex vivo optogenético se puede aplicar para evaluar nuevos patrones de conectividad utilizando un grupo de neuronas GABAérgicas en la amígdala, el clúster paracapsular intercalado celular (mpITC), como un ejemplo.
Introduction
herramientas precisas para la visualización y la activación simultánea de conexiones específicas entre las áreas del cerebro y los tipos específicos de neuronas son cada vez más importante en la comprensión de la conectividad funcional subyacentes de la función cerebral y la enfermedad estados sanos. Idealmente, esto implica la investigación de las propiedades fisiológicas precisas sinápticas con la que se comunican las neuronas identificadas. Esto es particularmente cierto para las conexiones entre las áreas del cerebro que no pueden ser preservados en una sola rebanada cerebral agudo. En el pasado, esto se ha conseguido en gran parte en experimentos separados. Por un lado, los trazadores inyectados neuronales in vivo se han empleado en combinación con la luz posterior o el análisis con microscopio electrónico de socios de pre y postsinápticos. Por otro lado, cuando tractos de fibras de la región de origen se conservan y accesible en la preparación rebanada, la estimulación eléctrica se ha utilizado para evaluar los mecanismos de comunicación sinápticas con las células en la región de destino.
Con el advenimiento de la optogenética, la expresión selectiva de cationes-canales de luz-gated, como Channelrhodopsins (CHRS) fusionado a las proteínas fluorescentes, ahora permite la activación de las neuronas y sus trayectorias axonales permitiendo al mismo tiempo su visualización y post-hoc análisis anatómico 1- 4. Debido a que los axones CHR-expresan pueden ser estimulados incluso cuando separado de somata matriz 5, es posible en rodajas de cerebro a: 1) evaluar las aportaciones de las regiones del cerebro que no eran accesibles con la estimulación eléctrica convencional, ya tractos de fibras no son separables o la trayectoria específica no se sabe; 2) identificar inequívocamente la región de origen de los insumos específicos que fueron postuladas pero no del todo comprendidas; y 3) investigar la conectividad funcional entre los tipos de células definidos, tanto a nivel local y en las proyecciones de largo alcance. Debido a una serie de ventajas, este mapeo optogenético de circuitos en cortes de cerebro se ha convertido en ampliaLy utilizado en los últimos años, y una variedad de vectores virales para la expresión de CHRS fluorescentemente etiquetado están fácilmente disponibles de proveedores comerciales. Algunas de las ventajas clave de activación optogenético sobre la estimulación eléctrica convencional hay daño al tejido debido a la colocación de electrodos de estimulación, la especificidad de la estimulación de la fibra debido a la estimulación eléctrica también puede reclutar fibras de paso o de otras células cercanas, y una estimulación igualmente rápida y temporalmente precisa. Además, la inyección estereotáxica de vectores virales fácilmente puede dirigirse a áreas específicas del cerebro 6 y expresión específica condicional o de tipo celular se puede lograr utilizando la expresión de Cre-dependiente y / o promotores específicos 7. A continuación, se aplica esta técnica para el mapeo de largo alcance y los circuitos locales en el sistema del miedo.
La amígdala es una región clave para la adquisición y expresión de miedo, y el almacenamiento de miedo y recuerdos emocionales 8,9. Aparte lado a otrom la amígdala, la corteza prefrontal medial (córtex prefrontal medial) y el hipocampo (HC), estructuras que están conectados recíprocamente a la amígdala, están implicados en los aspectos de la adquisición, consolidación y recuperación de miedo y extinción de recuerdos 10,11. Actividad en las subdivisiones de la mPFC parece desempeñar un doble papel en el control tanto de alta como de baja temor estados 12,13. Esto podría ser debido en parte mediado por conexiones directas desde el córtex prefrontal medial a la amígdala que controlaría la actividad de la amígdala y de salida. Por lo tanto, en los últimos años, varios estudios comenzaron en experimentos ex vivo rebanada para investigar las interacciones sinápticas entre los aferentes mPFC y células diana específicas en la amígdala 14-17.
Durante el aprendizaje miedo, la información sensorial sobre los estímulos condicionado e incondicionado alcanza la amígdala a través de las proyecciones de las regiones talámicas y corticales específicas. La plasticidad de estas entradas de las neuronas en la parte lateral (LA) del Basolamígdala ateral (BLA) es un importante mecanismo que subyace en el condicionamiento del miedo 9,18. La evidencia creciente sugiere que los procesos paralelos de plástico en la amígdala implican elementos inhibidores para controlar la memoria del miedo 19. Un grupo de neuronas inhibidoras agrupados son los paracapsular intercalado células mediales GABAérgicas (mpITCs), pero su conectividad y función precisa se entiende de manera incompleta 20-22. Aquí, la cartografía circuito optogenético se utiliza para evaluar la conectividad aferentes y eferentes de estas células y su impacto en las neuronas diana en la amígdala, lo que demuestra que mpITCs reciben información sensorial directa de estaciones de relevo talámicas y corticales 23. La expresión específica de la CDH en mpITCs o neuronas BLA permite representar las interacciones locales, revelando que mpITCs inhiben, sino que también están mutuamente activa, BLA neuronas principales, colocándolos en nuevos circuitos inhibitorios de alimentación directa y retroalimentación que controlan eficazmente la actividad BLA23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describe un método para la ex vivo investigación optogenético de los circuitos neuronales y la conectividad local que se pueden implementar fácilmente en la mayoría, si no todas, las verticales rebanada de grabación de patch-clamp configuraciones, equipándolos con un ~ 470 nm LED en el puerto de luz de epifluorescencia. Una ventaja importante de la estimulación optogenética de proyecciones axonales en rebanadas es que permite la activación y la investigación de las propiedades de las c…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Cora Hübner and Andrea Gall for help in acquiring some of the representative results. This work was supported by the Werner Reichardt Centre for Integrative Neuroscience (CIN) at the University of Tuebingen, an Excellence Initiative funded by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) within the framework of the Excellence Initiative (EXC 307), and by funds from the Charitable Hertie Foundation.
Materials
| Surgery | |||
| Stereotactic frame | Stoelting, USA | 51670 | can be replaced by other stereotactic frame for mice |
| Steretoxic frame mouse adaptor | Stoelting, USA | 51625 | |
| Gas anesthesia mask for mice | Stoelting, USA | 50264 | no longer available, replaced by item no. 51609M |
| Pressure injection device, Toohey Spritzer | Toohey Company, USA | T25-2-900 | other pressure injection devices (e.g. Picospritzer) can be used |
| Kwik Fill glass capillaries | World Precision Instruments, Germany | 1B150F-4 | |
| Anesthesia machine, IsoFlo | Eickemeyer, Germany | 213261 | |
| DC Temperature Controler and heating pad | FHC, USA | 40-90-8D | |
| Horizontal Micropipette Puller Model P-1000 | Sutter Instruments, USA | P-1000 | |
| Surgical tool sterilizer, Sterilizator 75 | Melag, Germany | 08754200 | |
| rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotype 2/9) | Penn Vector Core, USA | AV-9-26973P | |
| rAAV-CAGh-ChR2(H134R)-mCherry (serotype 2/9) | Penn Vector Core, USA | AV-9-20938M | |
| rAAV-EF1a-DIOhChR2(H134R)-YFP (serotype 2/1) | Penn Vector Core, USA | AV-1-20298P | |
| fast green | Roth, Germany | 0301.1 | |
| Isoflurane Anesthetic, Isofuran CP (1ml/ml) | CP Pharma, Germany | ||
| Antiseptic, Betadine (providone-iodine) | Purdure Products, USA | BSOL32 | can be replaced by other disinfectant |
| Analgesic, Metacam Solution (5mg/ml meloxicam) | Boehringer Ingelheim, Germany | can be replaced by other analgesics | |
| Bepanthen eye ointment | Bayer, Germany | 0191 | can be replaced by other eye ointment |
| Drill NM3000 (SNKG1341 and SNIH1681) | Nouvag, Switzerland | ||
| Sutranox Suture Needle | Fine Science Tools, Germany | 12050-01 | |
| Braided Silk Suture | Fine Science Tools, Germany | 18020-60 | |
| Recordings, light stimulation, and analysis | |||
| artificial cerebrospinal fluid (ACSF) | for composition see references #16 and #23 | ||
| internal patch solutions | for composition see references #16 and #23 | ||
| MagnesiumSulfate Heptahydrate | Roth, Germany | P027.1 | prepare 2M stock solution in purified water |
| Slicer, Microm HM650V | Fisher Scientific, Germany | 920120 | |
| Cooling unit for tissue slicer, CU65 | Fisher Scientific, Germany | 770180 | |
| Sapphire blade | Delaware Diamond Knives | custom order, inquire with company | |
| Stereoscope, SZX2-RFA16 | Olympus, Japan | ||
| Xcite fluorescent lamp (XI120Q-1492) | Lumen Dynamics Group, Canada | 2012-12699 | |
| Patch microscope, BX51WI | Olympus, Japan | ||
| Multiclamp 700B patch amplifier | Molecular Devices, USA | ||
| Digitdata 1440A | Molecular Devices, USA | ||
| PClamp software, Version 10 | Molecular Devices, USA | used to control data acquisition and stimulation | |
| Bath temperature controler, TC05 | Luigs & Neumann, Germany | 200-100 500 0145 | |
| Three axis micromanipulator Mini 25 | Luigs & Neumann, Germany | 210-100 000 0010 | |
| Micromanipulator controller SM7 | Luigs & Neumann, Germany | 200-100 900 7311 | |
| glass capillaries for patch pipettes | World Precision Instruments, Germany | GB150F-8P | |
| Cellulose nitrate filterpaper for interface chamber | Satorius Stedim Biotech, Germany | 13006–50—-ACN | |
| LED unit, CoolLED pE | CoolLED, UK | 244-1400 | CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation |
| CoolLED 100 Dual Adapt | CoolLED, UK | pE-ADAPTOR-50E | |
| LED unit, USL 70/470 | Rapp Optoelectronic | L70-000 | |
| Dual port adapter | Rapp Optoelectronic | inquire with company | |
| Filter set red (excitation) | AHF, Germany | F49-560 | Filters can be bought as set F46-008 |
| (beamsplitter) | AHF, Germany | F48-585 | |
| (emission) | AHF, Germany | F47-630 | |
| Filter set green (excitation) | AHF, Germany | F39-472 | Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission) |
| (beamsplitter) | AHF, Germany | F43-495W | |
| (emission) | AHF, Germany | F76-490 | |
| LaserCheck, handheld power meter | Coherent, USA | 1098293 | |
| IgorPro Software, Version 6 | Wavemetrics, USA | for electrophysiology data analysis, other alternative software packages can also be used | |
| Neuromatic suite of macros for IgorPro | http://www.neuromatic.thinkrandom.com | ||
| Post hoc analysis of injections and projections | |||
| Paraformaldehyde powder (PFA) | Roth, Germany | 0335.2 | |
| Neurotrace 435/455 blue fluorescent Nissl stain | Invitrogen | N-21479 | |
| agar-agar for embedding and resectioning | Roth, Germany | 5210.3 | |
| 30 x 10 mm petri dishes for embedding | SPL Life Sciences | alternatives can be used | |
| Slides, Super Frost | R. Langenbrinck, Germany | 61303802 | alternatives can be used |
| cover slips | R. Langenbrinck, Germany | 3000302 | alternatives can be used |
| Vecta Shield mounting medium | Vector Laboratories, USA | H-1000 | alternative mounting media can be used |
| cellulose nitrate filter for flattening slices for fixation | Satorius Stedim Biotech, Germany | 11406–25——N | |
| Confocal Laser Scanning Microscope LSM 710 | Zeiss, Germany | ||
Riferimenti
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