Ex vivo optogenetic Dissekering av skräck kretsar i hjärnan skivor
Summary
Optogenetic metoder används ofta för att manipulera neural aktivitet och bedöma konsekvenserna för hjärnans funktion. Här, är en teknik som beskrivs att vid in vivo-expression av den optiska aktivator channelrhodopsin, möjliggör ex vivo analys av synaptiska egenskaper hos specifika lång räckvidd och lokala neurala kopplingar i rädsla relaterade kretsar.
Abstract
Optogenetic tillvägagångssätt är nu allmänt används för att studera funktionen av neurala populationer och kretsar genom att kombinera riktad expression av ljusaktiverade proteiner och efterföljande manipulation av neural aktivitet genom ljus. Channelrhodopsins (ChRs) är ljus-gated katjon-kanaler och när smält till ett fluorescerande protein deras uttryck möjliggör visualisering och samtidig aktivering av specifika celltyper och deras axonala projektioner inom definierade områden av hjärnan. Via stereotaktisk injektion av virala vektorer, kan Chr fusionsproteiner konstitutivt eller villkorligt uttrycks i specifika celler i en definierad hjärnregion, och deras axonala projektioner kan därefter studeras anatomiskt och funktionellt via ex vivo optogenetic aktivering i hjärnan skivor. Detta är särskilt viktigt när syftet är att förstå synaptiska egenskaper av anslutningar som inte kunde lösas med konventionella elektriska stimuleringsmetoder, eller för att identifiera nya affehyra och efferent anslutning som tidigare dåligt kända. Här, några exempel illustrerar hur denna teknik kan tillämpas för att undersöka dessa frågor till att belysa rädsla relaterade kretsar i amygdala. Amygdala är en viktig region för förvärv och uttryck för rädsla, och lagring av rädsla och känslomässiga minnen. Många bevislinjer tyder på att den mediala prefrontala cortex (mPFC) deltar i olika aspekter av rädsla förvärv och utrotning, men dess exakta anslutning med amygdala är bara i början att förstå. Först visas hur ex vivo optogenetic aktivering kan användas för att studera aspekter av synaptisk kommunikation mellan mPFC afferenter och målceller i den basolaterala amygdala (BLA). Vidare är det illustreras hur kan tillämpas denna ex vivo optogenetic metod för att bedöma nya anslutningsmönster med användning av en grupp av GABA-erga neuroner i amygdala, den paracapsular inlagrade cellkluster (mpITC), som ett exempel.
Introduction
Exakta verktyg för visualisering och samtidig aktivering av specifika kopplingar mellan områden i hjärnan och vissa typer av nervceller blir allt viktigare att förstå de funktionella anslutnings underliggande friska hjärnans funktion och sjukdomstillstånd. Helst innebär det fysiologiska undersökning av exakta synaptiska egenskaper som identifierade nervceller kommunicerar. Detta gäller särskilt för anslutningar mellan områden i hjärnan som inte kan bevaras i en enda akut hjärn skiva. I det förflutna, har detta varit i stort sett uppnåtts i separata experiment. Å ena sidan, injiceras neurala spårämnen in vivo har använts i kombination med efterföljande ljus eller elektronmikroskopisk analys av pre-och postsynaptiska partners. Å andra sidan, när fiber skrifter från ursprungsregionen bevaras och tillgängliga i skiva beredning, elektrisk stimulering har använts för att bedöma synaptiska kommunikationsmekanismer med celler i målområdet.
Med tillkomsten av optogenetik, riktade uttryck av ljus gated kat-kanaler, såsom Channelrhodopsins (ChRs) sammansmält med fluorescerande proteiner, gör det nu möjligt aktivering av nervceller och deras axonala banor samtidigt som deras visualisering och post-hoc anatomisk analys 1- 4. Eftersom Chr-uttryck axoner kan stimuleras även när avskiljas från moder somata 5, är det möjligt i hjärnan skivor till: 1) bedöma ingångar från områden i hjärnan som inte var tillgänglig med konventionell elektrisk stimulering, eftersom fiber kontrakt inte kan avskiljas eller specifika bana är inte känd; 2) otvetydigt identifiera ursprungsregionen för specifika insatsvaror som postulerade men ofullständigt förstås; och 3) att undersöka den funktionella anslutning mellan definierade celltyper, både lokalt och i långdistans prognoser. På grund av ett antal fördelar, har detta optogenetic kartläggning av kretsar i hjärnan skivor blivit brettly använts under de senaste åren, och en mängd olika virala vektorer för expression av fluorescerande-taggade ChRs är lätt tillgängliga från kommersiella leverantörer. Några viktiga fördelar med optogenetic aktivering jämfört med konventionell elektrisk stimulering är inga skador på vävnaden på grund av placeringen av stimuleringselektroder, specificitet fiberstimulering eftersom elektrisk stimulering kan också rekrytera fibrer av passagen eller andra närliggande celler, och en lika snabb och tidsmässigt exakt stimulering. Dessutom kan stereotaktisk injektion av virala vektorer lätt riktas till specifika områden i hjärnan 6 och villkorligt eller celltyp specifika uttryck kan uppnås med hjälp av Cre-beroende uttryck och / eller specifika promotorer 7. Här är denna teknik tillämpas för kartläggning av långväga och lokala kretsar i rädsla systemet.
Amygdala är en viktig region för förvärv och uttryck för rädsla, och lagring av rädsla och känslomässiga minnen 8,9. Apart from amygdala, den mediala prefrontala cortex (mPFC) och hippocampus (HC), strukturer som ömsesidigt är kopplade till amygdala, är inblandade i olika aspekter av förvärv, konsolidering och hämtning av rädsla och utrotning minnen 10,11. Aktivitet i underavdelningar av mPFC verkar spela en dubbel roll i kontrollen både hög och låg rädsla påstår 12,13. Detta kan delvis förmedlas genom direkta förbindelser från mPFC till amygdala som skulle kontrollera amygdala aktivitet och produktion. Därför under de senaste åren har flera studier startade i ex vivo slice experiment för att undersöka synaptiska interaktioner mellan mPFC afferenter och specifika målceller i amygdala 14-17.
Under rädsla lärande, sensorisk information om rade och obetingade stimuli når amygdala via prognoser från specifika talamiska och kortikala regionerna. Plasticitet av dessa ingångar till neuroner i den laterala delen (LA) för basolateral amygdala (BLA) är en viktig mekanism som ligger bakom rädsla konditione 9,18. Ökande bevis tyder på att parallella plast processer i amygdala innebär hämmande element för att styra rädsla minne 19. En grupp klustrade hämmande nervceller är GABAergic mediala paracapsular inskjutna celler (mpITCs), men deras exakta anslutning och funktion är ofullständigt känd 20-22. Här är optogenetic krets kartläggning används för att bedöma afferenta och efferenta anslutning av dessa celler och deras inverkan på mål neuroner i amygdala, vilket visar att mpITCs få direkt sinnesintryck från talamiska och kortikala relästationer 23. Specifikt uttryck av Chr i mpITCs eller BLA nervceller möjliggör kartläggning av lokala interaktioner, avslöjar att mpITCs hämmar, utan även inbördes aktiveras genom BLA huvud nervceller, placera dem i nya feed-forward och återkoppling hämmande kretsar som effektivt styr BLA aktivitet23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll beskriver en metod för ex vivo optogenetic undersökning av nervbanor och lokala anslutningar som enkelt kan implementeras på de flesta, om inte alla, upprätt skiva patch-clamp inspelning inställningar genom att förse dem med en ~ 470 nm LED i epifluorescence ljus port. En stor fördel med optogenetic stimulering av axonal prognoser i skivor är att det möjliggör för specifik aktivering och undersökning av egenskaper hos anslutningar som inte var tillgänglig med konventionell elektrisk…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Cora Hübner and Andrea Gall for help in acquiring some of the representative results. This work was supported by the Werner Reichardt Centre for Integrative Neuroscience (CIN) at the University of Tuebingen, an Excellence Initiative funded by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) within the framework of the Excellence Initiative (EXC 307), and by funds from the Charitable Hertie Foundation.
Materials
| Surgery | |||
| Stereotactic frame | Stoelting, USA | 51670 | can be replaced by other stereotactic frame for mice |
| Steretoxic frame mouse adaptor | Stoelting, USA | 51625 | |
| Gas anesthesia mask for mice | Stoelting, USA | 50264 | no longer available, replaced by item no. 51609M |
| Pressure injection device, Toohey Spritzer | Toohey Company, USA | T25-2-900 | other pressure injection devices (e.g. Picospritzer) can be used |
| Kwik Fill glass capillaries | World Precision Instruments, Germany | 1B150F-4 | |
| Anesthesia machine, IsoFlo | Eickemeyer, Germany | 213261 | |
| DC Temperature Controler and heating pad | FHC, USA | 40-90-8D | |
| Horizontal Micropipette Puller Model P-1000 | Sutter Instruments, USA | P-1000 | |
| Surgical tool sterilizer, Sterilizator 75 | Melag, Germany | 08754200 | |
| rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotype 2/9) | Penn Vector Core, USA | AV-9-26973P | |
| rAAV-CAGh-ChR2(H134R)-mCherry (serotype 2/9) | Penn Vector Core, USA | AV-9-20938M | |
| rAAV-EF1a-DIOhChR2(H134R)-YFP (serotype 2/1) | Penn Vector Core, USA | AV-1-20298P | |
| fast green | Roth, Germany | 0301.1 | |
| Isoflurane Anesthetic, Isofuran CP (1ml/ml) | CP Pharma, Germany | ||
| Antiseptic, Betadine (providone-iodine) | Purdure Products, USA | BSOL32 | can be replaced by other disinfectant |
| Analgesic, Metacam Solution (5mg/ml meloxicam) | Boehringer Ingelheim, Germany | can be replaced by other analgesics | |
| Bepanthen eye ointment | Bayer, Germany | 0191 | can be replaced by other eye ointment |
| Drill NM3000 (SNKG1341 and SNIH1681) | Nouvag, Switzerland | ||
| Sutranox Suture Needle | Fine Science Tools, Germany | 12050-01 | |
| Braided Silk Suture | Fine Science Tools, Germany | 18020-60 | |
| Recordings, light stimulation, and analysis | |||
| artificial cerebrospinal fluid (ACSF) | for composition see references #16 and #23 | ||
| internal patch solutions | for composition see references #16 and #23 | ||
| MagnesiumSulfate Heptahydrate | Roth, Germany | P027.1 | prepare 2M stock solution in purified water |
| Slicer, Microm HM650V | Fisher Scientific, Germany | 920120 | |
| Cooling unit for tissue slicer, CU65 | Fisher Scientific, Germany | 770180 | |
| Sapphire blade | Delaware Diamond Knives | custom order, inquire with company | |
| Stereoscope, SZX2-RFA16 | Olympus, Japan | ||
| Xcite fluorescent lamp (XI120Q-1492) | Lumen Dynamics Group, Canada | 2012-12699 | |
| Patch microscope, BX51WI | Olympus, Japan | ||
| Multiclamp 700B patch amplifier | Molecular Devices, USA | ||
| Digitdata 1440A | Molecular Devices, USA | ||
| PClamp software, Version 10 | Molecular Devices, USA | used to control data acquisition and stimulation | |
| Bath temperature controler, TC05 | Luigs & Neumann, Germany | 200-100 500 0145 | |
| Three axis micromanipulator Mini 25 | Luigs & Neumann, Germany | 210-100 000 0010 | |
| Micromanipulator controller SM7 | Luigs & Neumann, Germany | 200-100 900 7311 | |
| glass capillaries for patch pipettes | World Precision Instruments, Germany | GB150F-8P | |
| Cellulose nitrate filterpaper for interface chamber | Satorius Stedim Biotech, Germany | 13006–50—-ACN | |
| LED unit, CoolLED pE | CoolLED, UK | 244-1400 | CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation |
| CoolLED 100 Dual Adapt | CoolLED, UK | pE-ADAPTOR-50E | |
| LED unit, USL 70/470 | Rapp Optoelectronic | L70-000 | |
| Dual port adapter | Rapp Optoelectronic | inquire with company | |
| Filter set red (excitation) | AHF, Germany | F49-560 | Filters can be bought as set F46-008 |
| (beamsplitter) | AHF, Germany | F48-585 | |
| (emission) | AHF, Germany | F47-630 | |
| Filter set green (excitation) | AHF, Germany | F39-472 | Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission) |
| (beamsplitter) | AHF, Germany | F43-495W | |
| (emission) | AHF, Germany | F76-490 | |
| LaserCheck, handheld power meter | Coherent, USA | 1098293 | |
| IgorPro Software, Version 6 | Wavemetrics, USA | for electrophysiology data analysis, other alternative software packages can also be used | |
| Neuromatic suite of macros for IgorPro | http://www.neuromatic.thinkrandom.com | ||
| Post hoc analysis of injections and projections | |||
| Paraformaldehyde powder (PFA) | Roth, Germany | 0335.2 | |
| Neurotrace 435/455 blue fluorescent Nissl stain | Invitrogen | N-21479 | |
| agar-agar for embedding and resectioning | Roth, Germany | 5210.3 | |
| 30 x 10 mm petri dishes for embedding | SPL Life Sciences | alternatives can be used | |
| Slides, Super Frost | R. Langenbrinck, Germany | 61303802 | alternatives can be used |
| cover slips | R. Langenbrinck, Germany | 3000302 | alternatives can be used |
| Vecta Shield mounting medium | Vector Laboratories, USA | H-1000 | alternative mounting media can be used |
| cellulose nitrate filter for flattening slices for fixation | Satorius Stedim Biotech, Germany | 11406–25——N | |
| Confocal Laser Scanning Microscope LSM 710 | Zeiss, Germany | ||
Riferimenti
- Nagel, G. et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940-13945, (2003).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., & Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268, (2005).
- Tye, K. M., & Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nat Rev Neurosci. 13 (4), 251-266, (2012).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., & Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34, (2011).
- Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., & Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nat Neurosci. 10 (5), 663-668, (2007).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., & Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat Protoc. 1 (6), 3166-3173, (2006).
- Huang, Z. J., & Zeng, H. Genetic approaches to neural circuits in the mouse. Annu Rev Neurosci. 36, 183-215, (2013).
- LeDoux, J. E. Emotion circuits in the brain. Annu Rev Neurosci. 23, 155-184, (2000).
- Pape, H. C., & Pare, D. Plastic synaptic networks of the amygdala for the acquisition, expression, and extinction of conditioned fear. Physiol Rev. 90 (2), 419-463, (2010).
- Myers, K. M., & Davis, M. Mechanisms of fear extinction. Mol Psychiatry. 12 (2), 120-150, (2007).
- Quirk, G. J., & Mueller, D. Neural mechanisms of extinction learning and retrieval. Neuropsychopharmacology. 33 (1), 56-72, (2008).
- Vidal-Gonzalez, I., Vidal-Gonzalez, B., Rauch, S. L., & Quirk, G. J. Microstimulation reveals opposing influences of prelimbic and infralimbic cortex on the expression of conditioned fear. Learn Mem. 13 (6), 728-733, (2006).
- Sierra-Mercado, D., Padilla-Coreano, N., & Quirk, G. J. Dissociable roles of prelimbic and infralimbic cortices, ventral hippocampus, and basolateral amygdala in the expression and extinction of conditioned fear. Neuropsychopharmacology. 36 (2), 529-538, (2011).
- Cho, J. H., Deisseroth, K., & Bolshakov, V. Y. Synaptic encoding of fear extinction in mPFC-amygdala circuits. Neuron. 80 (6), 1491-1507, (2013).
- Arruda-Carvalho, M., & Clem, R. L. Pathway-Selective Adjustment of Prefrontal-Amygdala Transmission during Fear Encoding. J Neurosci. 34 (47), 15601-15609, (2014).
- Hubner, C., Bosch, D., Gall, A., Luthi, A., & Ehrlich, I. Ex vivo dissection of optogenetically activated mPFC and hippocampal inputs to neurons in the basolateral amygdala: implications for fear and emotional memory. Front Behav Neurosci. 8, 64, (2014).
- Strobel, C., Marek, R., Gooch, H. M., Sullivan, R. K., & Sah, P. Prefrontal and Auditory Input to Intercalated Neurons of the Amygdala. Cell Rep. 10 (9), 1435-1442, (2015).
- Sigurdsson, T., Doyere, V., Cain, C. K., & LeDoux, J. E. Long-term potentiation in the amygdala: a cellular mechanism of fear learning and memory. Neuropharmacology. 52 (1), 215-227, (2007).
- Ehrlich, I., Humeau, Y., Grenier, F., Ciocchi, S., Herry, C., & Luthi, A. Amygdala inhibitory circuits and the control of fear memory. Neuron. 62 (6), 757-771, (2009).
- Millhouse, O. E. The intercalated cells of the amygdala. J Comp Neurol. 247 (2), 246-271, (1986).
- Busti, D. et al. Different fear states engage distinct networks within the intercalated cell clusters of the amygdala. J Neurosci. 31 (13), 5131-5144, (2011).
- Palomares-Castillo, E., Hernandez-Perez, O. R., Perez-Carrera, D., Crespo-Ramirez, M., Fuxe, K., & Perez de la Mora, M. The intercalated paracapsular islands as a module for integration of signals regulating anxiety in the amygdala. Brain Res. 1476, 211-234, (2012).
- Asede, D., Bosch, D., Luthi, A., Ferraguti, F., & Ehrlich, I. Sensory inputs to intercalated cells provide fear-learning modulated inhibition to the basolateral amygdala. Neuron. 86 (2), 541-554, (2015).
- Tamamaki, N., Yanagawa, Y., Tomioka, R., Miyazaki, J., Obata, K., & Kaneko, T. Green fluorescent protein expression and colocalization with calretinin, parvalbumin, and somatostatin in the GAD67-GFP knock-in mouse. J Comp Neurol. 467 (1), 60-79, (2003).
- Mar, L., Yang, F. C., & Ma, Q. Genetic marking and characterization of Tac2-expressing neurons in the central and peripheral nervous system. Mol Brain. 5, 3, (2012).
- Jackman, S. L., Beneduce, B. M., Drew, I. R., & Regehr, W. G. Achieving high-frequency optical control of synaptic transmission. J Neurosci. 34 (22), 7704-7714, (2014).
- Li, H., Penzo, M. A., Taniguchi, H., Kopec, C. D., Huang, Z. J., & Li, B. Experience-dependent modification of a central amygdala fear circuit. Nat Neurosci. 16 (3), 332-339, (2013).
- Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., & Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457 (7233), 1142-1145, (2009).
- Felix-Ortiz, A. C., Beyeler, A., Seo, C., Leppla, C. A., Wildes, C. P., & Tye, K. M. BLA to vHPC inputs modulate anxiety-related behaviors. Neuron. 79 (4), 658-664, (2013).
- Chu, H. Y., Ito, W., Li, J., & Morozov, A. Target-specific suppression of GABA release from parvalbumin interneurons in the basolateral amygdala by dopamine. J Neurosci. 32 (42), 14815-14820, (2012).
- Zhang, Y. P., & Oertner, T. G. Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel. Nat Methods. 4 (2), 139-141, (2007).
- Britt, J. P., Benaliouad, F., McDevitt, R. A., Stuber, G. D., Wise, R. A., & Bonci, A. Synaptic and behavioral profile of multiple glutamatergic inputs to the nucleus accumbens. Neuron. 76 (4), 790-803, (2012).
- Kohl, M. M., Shipton, O. A., Deacon, R. M., Rawlins, J. N., Deisseroth, K., & Paulsen, O. Hemisphere-specific optogenetic stimulation reveals left-right asymmetry of hippocampal plasticity. Nat Neurosci. 14 (11), 1413-1415, (2011).
- Morozov, A., Sukato, D., & Ito, W. Selective suppression of plasticity in amygdala inputs from temporal association cortex by the external capsule. J Neurosci. 31 (1), 339-345, (2011).
- Davidson, B. L., & Breakefield, X. O. Viral vectors for gene delivery to the nervous system. Nat Rev Neurosci. 4 (5), 353-364, (2003).
- Aschauer, D. F., Kreuz, S., & Rumpel, S. Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain. PLoS One. 8 (9), e76310, (2013).
- Salegio, E. A. et al. Axonal transport of adeno-associated viral vectors is serotype-dependent. Gene Ther. 20 (3), 348-352, (2013).
- Holehonnur, R. et al. Adeno-associated viral serotypes produce differing titers and differentially transduce neurons within the rat basal and lateral amygdala. BMC Neurosci. 15, 28, (2014).
- McFarland, N. R., Lee, J. S., Hyman, B. T., & McLean, P. J. Comparison of transduction efficiency of recombinant AAV serotypes 1, 2, 5, and 8 in the rat nigrostriatal system. J Neurochem. 109 (3), 838-845, (2009).
- Miyashita, T., Shao, Y. R., Chung, J., Pourzia, O., & Feldman, D. E. Long-term channelrhodopsin-2 (ChR2) expression can induce abnormal axonal morphology and targeting in cerebral cortex. Front Neural Circuits. 7, 8, (2013).
