Selektiv Cell Elimination fra Mixed 3D Kultur Ved hjelp av en nær-infrarødt Photoimmunotherapy Technique

Summary

Eliminating specific cells without damaging other cells is extremely difficult, especially in established tissue, yet there is an urgent need for a cell elimination method in the tissue engineering field. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture using near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT).

Abstract

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem cell (iPS) emerged as a new method in regenerative medicine. Although this tissue regeneration is promising, contamination with unwanted cells during tissue cultures is a major concern. Moreover, there is a safety concern regarding tumorigenicity after transplantation. Therefore, there is an urgent need for eliminating specific cells without damaging other cells that need to be protected, especially in established tissue. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture in vitro with near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT) without damaging non-targeted cells. This technique enables the elimination of specific cells from mixed cell cultures or tissues.

Introduction

Eliminere spesifikke celler uten å skade andre celler er ekstremt vanskelig, spesielt i etablert vev, og det er et stort behov for en celle eliminasjonsmetoden i tissue engineering feltet. Dag innen regenerativ medisin, vevkulturer ved hjelp av embryonale stamceller (ES), pluripotente stamceller (pscs), eller indusert pluripotent stamcelle (IPS) er lovende materialer ^{1 – 3.}

Selv om dette vev gjenfødelse er lovende, er forurensning med uønskede celler et stort problem. Videre er det et sikkerhetshensyn av tumorgenisitet etter transplantasjon ^4,5. Selv om mange studier har fokusert på disse spørsmålene for å eliminere spesifikke celler, spesielt i regenerativ medisin ^6-8, har ingen praktisk metode blitt utviklet.

Nær infrarød photoimmunotherapy (NIR-PIT) er en behandling basert på et antistoff-photoabsorber konjugerte (APC). En APC består av en celle-spesifikt monoklonalt antistoff (mAb) og en photoabsorber, IR700. IR700 er en hydrofil silika-phthalocyanine derivat og ikke forårsaker fototoksisitet av seg selv ^9. IR700 er kovalent konjugert til antistoffet via amid-rester på sidekjeden av lysin molekyler. APC binder målmolekylene på cellemembranen og induserer deretter nesten øyeblikkelig cellenekrose etter eksponering for NIR-lys ved 690 nm. Under eksponering for NIR-lys, cellemembranen brister som fører til celledød ^9-14. NIR-PIT har vist seg å være effektiv med flere antistoffer eller antistoff-fragmenter, inkludert anti-EGFR, anti-HER2, anti-PSMA, anti-CD25, anti-mesothelin, anti-GPC3, og anti-CEA ^{15 – 21.} Derfor kan NIR-PIT anvendes mot et bredt spekter av mål-molekyler. Videre er NIR-PIT en godt kontrollert behandling som gjør at selektiv behandling av spesifikke områder ved å begrense NIR-light bestråling ^18,22.

Her presenterer vi en metode for bestemt celle eliminering ved hjelp av NIR-PIT fra blandede 3D kulturer.

Protocol

Merk: Følgende protokollen beskriver de nødvendige skritt for å eliminere bestemte celler ved hjelp av NIR-PIT. Kontroller og andre detaljer om NIR-PIT og celleviabilitet kan finnes andre steder 18. 1. Bøyning av IR700 til monoklonale antistoffer (mAb) Forbered mAb av interesse ved 2-5 mg / ml i 0,1 M Na HPO 2 4 (pH 8,6) oppløsning. Bland 6,8 nmol av mAb med 30,8 nmol av 10 mM IR700 i 0,1 M Na HPO 2 4-løsning (pH 8,6) i et mikrosen…

Representative Results

Optisk å overvåke virkningen av NIR-PIT, A431-cellelinjen, som overuttrykker EGFR, var genetisk modifisert til å uttrykke også GFP og luciferase (A431-luc-GFP). Som et ikke-target av NIR-PIT, ble Balb / 3T3-cellelinje optisk modifisert for å uttrykke RFP (3T3-RFP). APC, panitumumab-IR700 (pan-IR700), ble syntetisert. Blandede sfæroider, som var sammensatt av forskjellige forhold mellom celler (A431-luc-GFP og 3T3-RFP) ble fremstilt i henhold til denne protokollen (figur 1)….

Discussion

Vi viser en metode for spesifikk celle eliminering fra en blandet 3D-cellekultur uten skade på ikke-målceller ved hjelp av NIR-PIT. Så langt er det ingen praktisk metode for eliminering celle når vev er etablert, eller etter transplantasjon. Således er NIR-PIT en lovende metode for å oppnå dette. Denne teknikken kan også bli anvendt in vivo ^18,22, ettersom APCer viser lignende farmakokinetikk som mAb seg selv. Målcellen typen kan tilpasses med forskjellige APC. Forskjellige antistof…

Materials

IRDye 700DX Ester Infrared Dye	LI-COR Bioscience (Lincoln, NE, USA)	929-70011
Na2HPO4	SIGMA-ALDRICH (St. Louis, MO, USA)	S9763
Sephadex G25 column (PD-10)	GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA)	17-0851-01
Coomassie (bradford) Plus protein assay	Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA)	PI-23200
Perfecta3D 96-Well hanging Drop Plates	3D Biomatrix Inc (Ann Arbor, MI, USA)	HDP1096-8
Optical power meter	Thorlabs (Newton, NJ, USA)	PM100
LED: L690-66-60	Marubeni America Co. (Santa Clara, CA, USA)	L690-66-60
Vectibix (panitumumab)	Amgen (Thousand Oaks, CA, USA)
35mm glass bottom dish, dish size 35mm, well size 10mm	Cellvis (Mountain View, CA, USA)	D35-10-0-N