Selektiv Cell Eliminering från Mixed 3D kultur med hjälp av en Near Infrared Photoimmunotherapy Technique

Summary

Eliminating specific cells without damaging other cells is extremely difficult, especially in established tissue, yet there is an urgent need for a cell elimination method in the tissue engineering field. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture using near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT).

Abstract

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem cell (iPS) emerged as a new method in regenerative medicine. Although this tissue regeneration is promising, contamination with unwanted cells during tissue cultures is a major concern. Moreover, there is a safety concern regarding tumorigenicity after transplantation. Therefore, there is an urgent need for eliminating specific cells without damaging other cells that need to be protected, especially in established tissue. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture in vitro with near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT) without damaging non-targeted cells. This technique enables the elimination of specific cells from mixed cell cultures or tissues.

Introduction

Eliminera specifika celler utan att skada andra celler är extremt svårt, särskilt i etablerade vävnad, och det finns ett brådskande behov av en eliminering cellmetod i tissue engineering fältet. Nuförtiden inom området regenerativ medicin, vävnadskulturer med användning av embryonala stamceller (ES), pluripotenta stamceller (PSC) eller inducerade pluripotenta stamceller (iPS) är lovande material ^{1 – 3.}

Även om denna vävnadsregenerering är lovande, är kontaminering med oönskade celler ett stort problem. Dessutom finns det en oro för säkerheten av tumörbildning efter transplantation ^4,5. Även om många studier har fokuserat på dessa frågor för att eliminera specifika celler, särskilt inom regenerativ medicin ^6-8, har ingen praktisk metod utvecklats.

Nära infraröd photoimmunotherapy (NIR-PIT) är en metod som bygger på en antikropp-photoabsorber conjugate (APC). En APC består av en cellspecifik monoklonal antikropp (mAb) och en photoabsorber, IR700. IR700 är en hydrofil kiseldioxid-ftalocyanin-derivat och inducerar inte fototoxicitet i sig ^nio. IR700 är kovalent konjugerad till antikroppen via amid-rester på sidokedjan i lysin-molekyler. APC binder målmolekyler på cellmembranet och sedan inducerar nästan omedelbar cellnekros efter exponering för NIR-ljus vid 690 nm. Under exponering för NIR-ljus, det cellulära membranet brister som leder till celldöd ^9-14. NIR-PIT har visat sig vara effektivt med flera antikroppar eller antikroppsfragment, inklusive anti-EGFR, anti-HER2, anti-PSMA, anti-CD25, anti-mesotelin, anti-GPC3, och anti-CEA ^15-21. Därför kan NIR-PIT användas mot ett stort antal olika målmolekyler. Dessutom är NIR-PIT en väl kontrollerad behandling som tillåter selektiv behandling av specifika regioner genom att begränsa NIR-light bestrålning ^18,22.

Här presenterar vi en metod för specifik cell eliminering med hjälp av NIR-PIT från blandade 3D kulturer.

Protocol

Obs: Följande protokoll beskriver de åtgärder som krävs för att undanröja specifika celler med hjälp av NIR-PIT. Kontroller och andra detaljer om NIR-PIT och cellviabilitet kan hittas någon annanstans 18. 1. Konjugering av IR700 till monoklonala antikroppar (mAb) Förbered mAb av intresse vid 2-5 mg / ml i 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,6) lösning. Blanda 6,8 nmol av mAb med 30,8 nmol 10 mM IR700 i 0,1 M Na 2 HPO 4-lösning (pH 8,6) i e…

Representative Results

Att optiskt övervaka effekterna av NIR-PIT, A431 cellinje som överuttrycker EGFR var genetiskt modifierad för att också uttrycka GFP och luciferas (A431-luc-GFP). Som en icke-mål av NIR-PIT, var Balb / 3T3 cellinje optiskt modifierad för att uttrycka RFP (3T3-RFP). APC, panitumumab-IR700 (pan-IR700), syntetiserades. Blandade sfäroider, som består av olika förhållanden mellan celler (A431-luc-GFP och 3T3-RFP) tillverkades enligt detta protokoll (Figur 1). Upprep…

Discussion

Vi visar en metod för specifik eliminering cell från en blandad 3D cellkultur utan att skada icke-målceller med hjälp av NIR-PIT. Hittills finns det ingen praktisk metod för eliminering cell när vävnaden är etablerad eller efter transplantation. Sålunda är NIR-PIT en lovande metod för att åstadkomma detta. Denna teknik kan också användas in vivo ^18,22, eftersom APC visar liknande farmakokinetik som mAb själv. Typen målcellen kan anpassas med olika APC. Olika antikroppar eller…

Materials

IRDye 700DX Ester Infrared Dye	LI-COR Bioscience (Lincoln, NE, USA)	929-70011
Na2HPO4	SIGMA-ALDRICH (St. Louis, MO, USA)	S9763
Sephadex G25 column (PD-10)	GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA)	17-0851-01
Coomassie (bradford) Plus protein assay	Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA)	PI-23200
Perfecta3D 96-Well hanging Drop Plates	3D Biomatrix Inc (Ann Arbor, MI, USA)	HDP1096-8
Optical power meter	Thorlabs (Newton, NJ, USA)	PM100
LED: L690-66-60	Marubeni America Co. (Santa Clara, CA, USA)	L690-66-60
Vectibix (panitumumab)	Amgen (Thousand Oaks, CA, USA)
35mm glass bottom dish, dish size 35mm, well size 10mm	Cellvis (Mountain View, CA, USA)	D35-10-0-N