Aislamiento de leucocitos infiltrantes de ratón Piel Usando enzimática Digest y Separación de degradado
Summary
This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.
Abstract
Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.
Introduction
No se encontraron enfermedades de la piel que van desde dermatitis de contacto, eczema, psoriasis, celulitis, infecciones por hongos y abscesos a los cánceres de piel no melanoma de estar entre las 50 enfermedades más prevalentes en todo el mundo, y la cuarta causa mundial de enfermedades no mortales en 2010 1. Por consiguiente, la investigación de los mecanismos moleculares y celulares que subyacen a diversas patologías de la piel es un área necesaria y activa de investigación. Modelos de roedores han sido notablemente útil en la comprensión de las condiciones inflamatorias de la piel tales como dermatitis atópica 2, 3 psoriasis, o infección Staphylococcus aureus 4. Protocolos de bajo costo, eficientes y simples para la digestión enzimática de tejido de la piel del ratón pueden proporcionar preparaciones de células que se pueden utilizar para una variedad de aplicaciones posteriores para entender mejor la fisiopatología de enfermedades de la piel. Aquí, un método sencillo y económico se describe, por digestión enzimática de la piel del ratónel tejido de la piel y el aislamiento de leucocitos infiltrantes que puede ser utilizado para el cultivo celular, la transferencia adoptiva in vivo, análisis citométrico de flujo y clasificación o estudios de expresión génica. El objetivo general de este procedimiento consiste en preparar una suspensión de células de leucocitos infiltrantes de piel con la viabilidad celular alta y reducir al mínimo los costos normalmente asociados con kits de reactivos de encargo y disociadores mecánicos.
Métodos de disociación del tejido de la piel existentes 5-7 pueden resultar en una baja viabilidad celular y la superficie de la integridad marcador, o requerir kits enzimáticos personalizados y costosas máquinas de disociación de tejidos 8-11. Mientras que la digestión de los tejidos de la piel de oreja de ratón es razonablemente frecuente 12-13 de la digestión de tejidos de la piel altamente queratinizado (por ejemplo, desde el flanco) puede resultar en preparaciones de células contaminadas con grandes cantidades de escombros no celular. En un estudio reciente, Zaid y colegas digeridos ratón piel flanco durante 90 minutos en 2,5 mg / ml de dispasa, Folloconducido por 45 min en 3 mg / ml de colagenasa 7. En otro estudio, estos investigadores utilizaron múltiples incubaciones con una digestión combinada de 2,5 hr, incluyendo el uso de tripsina / EDTA, colagenasa III, y dispasa 5. No se recomienda el uso de tripsina durante la digestión enzimática de la piel, como se ha demostrado que el tratamiento con tripsina de diferentes fabricantes para afectar apreciablemente la integridad de las proteínas de la superficie celular en células de mamífero 14-15. Además, dispasa puede tener efectos significativos sobre las capacidades proliferativas de células CD4 y CD8a T y afectar a la abundancia de superficie de al menos 20 moléculas, incluyendo T común marcadores de activación celular, tales como CD62L 16. Otros protocolos utilizan RPMI 1640 en el medio de la digestión 6. Sin embargo, la presencia de Mg2 + y Ca2 + en medio RPMI puede causar la agregación extensa celular 17.
Un protocolo ideal para la disociación del tejido debe aspirar a la viabilidad celular alta, bajaniveles de agregación celular, y un daño mínimo a proteínas de la superficie celular. Preparaciones de células del estroma de los ganglios linfáticos de alta calidad se han cumplido con los protocolos que utilizan incubaciones enzimáticas más cortos, Ca 2+ y Mg 2+ medios de comunicación libres, y evitar la tripsina y Dispasa 18. Sin embargo, los protocolos de este tipo no se han establecido para la disociación de la piel entera de ratón.
Aquí, un protocolo se describe a disociar, aislar y enriquecer los leucocitos infiltrantes de la piel de la piel del flanco del ratón alergeno-desafió. Brevemente, piel extirpada se pre-incubó en solución salina equilibrada de Hank (HBSS) con suero bovino fetal al 10% durante 1 hora para suavizar el tejido para la digestión y eliminar cualquier exceso de piel o tejido graso muerto. Esto es seguido por una etapa de digestión enzimática 30 min con 0,7 mg / ml de colagenasa D. colagenasa D tiene efectos mínimos sobre la densidad de marcadores de superficie celular, y ningún efecto sobre la proliferación de células T in vitro 16,18, por lo que esmuy adecuado para aplicaciones que implican la caracterización de proteínas de la superficie. Después de la digestión enzimática, se utilizó centrifugación en gradiente de densidad discontinuo para eliminar las células epiteliales y los restos de la suspensión de una sola célula y enriquecer para las células hematopoyéticas. Es importante destacar que este procedimiento evita costosos reactivos separación celular magnética basada en la columna de disociación y máquinas de tejido 8-11, y se puede realizar con el equipo y los materiales encontrados en un laboratorio de investigación básica biomédica. Aquí se utiliza este protocolo para aislar los leucocitos de la piel flanco desafiado tres veces con la oxazolona hapteno (buey) en ratones ND4 suizos previamente sensibilizados (adaptado de 19). Las células se analizaron mediante citometría de flujo multiparamétrica. Esta técnica produjo una suspensión de células con los desechos mínimo y> 95% de viabilidad de los linfocitos aislados que fueron analizados por el flujo multi-paramétrico citometría para medir la infiltración de linfocitos y neutrófilos T en el sk afectadaen.
Protocol
Representative Results
Discussion
La caracterización de los cambios en los leucocitos de la piel-residente en modelos de roedores de enfermedades de la piel tales como dermatitis atópica o psoriasis es importante para la comprensión de las conexiones mecánicas entre la afluencia de células inflamatorias y patología de la enfermedad. Aquí se describe una técnica económica para aislar leucocitos de tejidos de la piel con el equipo básico que se encuentra en la mayoría de los laboratorios de investigación biomédica. Esta relativamente rápida …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los Institutos Nacionales de Salud (NIH R15 NS067536-01A1 a DC), la Asociación Nacional de vulvodinia (premio a DC), y Macalester College apoyaron este trabajo. CB recibió una beca del Programa de Beckman estudiosos Macalester College, financiado por la Fundación Mabel Beckman Arnold y. BTF y TM son compatibles con JDRF 2-2011-662. Agradecemos al Dr. Jason Schenkel y el Dr. Juliana Lewis para el asesoramiento técnico, y todos los miembros actuales y anteriores del laboratorio Chatterjea por su ayuda y apoyo.
Materials
| HBSS with phenol red, without calcium, without magnesium, liquid | Sigma Aldrich | 55021C | Keep sterile until day of usage. |
| HEPES, ≥99.5% (titration) | Sigma Aldrich | H3375 | |
| EDTA disodium salt solution | Sigma Aldrich | E7889 | Keep sterile until day of usage. |
| Fetal Bovine Serum, USDA, Heat Inactivated, Premium Select | MidSci | S01520HI | Keep sterile until day of usage. |
| Percoll, pH 8.5-9.5 (25°C) | Sigma Aldrich | P1644 | Keep sterile. Percoll needs to be made isotonic with sterile 10X PBS prior to use. |
| Trimmer Combo Kit | Kent Scientific | CL9990-1201 | Use the larger trimmer for shaving the flank and back. |
| 4-Ethoxymethylene-2-phenyl-2-oxazolin-5-one | Sigma Aldrich | E0753-10G | Dissolve in 100% EtOH at 50°C for 15 minutes on a rotating plate. |
| Purified anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2) | Tonbo Biosciences | 70-0161 | Antibody used to block non-specific antibody binding during antibody staining for flow cytometry |
| anti-CD3e-BV650 (145-2C11) | Becton Dickinson | 564378 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD4-APC-eFluor780 (RM4-5) | eBioscience | 47-0042-80 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD8a-BV785 (53-6.7) | BioLegend | 100749 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD11b-eFluor450 (M1/70) | eBioscience | 48-0112-80 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD11c-eFluor450 (N418) | eBioscience | 48-0114-80 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD44-BV711 (IM7) | Becton Dickinson | 563971 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD45-FITC (30-F11) | Tonbo Biosciences | 35-0451-U025 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD45R-eFluor450 (RA3-6B2) | eBioscience | 48-0452-80 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD62L-PerCP-Cy5.5 (MEL-14) | BioLegend | 104431 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)-PE (RB6-8C5) | BioLegend | 108407 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| Ghost Dye-BV510 | Tonbo Biosciences | 13-0870-T100 | Viability dye for flow cytometry |
| LSR Fortessa | Becton Dickinson | N/A | Cell analyzer (18 parameters) |
| Collagenase D from Clostridium histolyticum | Roche Applied Science | 11088858001 | Aliquot lyophilized enzyme at 5 mg/mL in HBSS with phenol red, without calcium, and without magnesium into 1 mL aliquots. Store immediately at -20°C for up to six months. |
| ND4 Swiss female mice | Harlan | 0-32 | 8-12 weeks old; conventionally housed with free access to food and water and used according to Macalester College's IACUC guidelines. |
Riferimenti
- Hay, R. J., et al. The Global Burden of Skin Disease in 2010: An Analysis of the Prevalence and Impact of Skin Conditions. J. Invest. Dermatol. 134 (6), 1-8 (2013).
- Honda, T., Egawa, G., Grabbe, S., & Kabashima, K. Update of immune events in the murine contact hypersensitivity model: toward the understanding of allergic contact dermatitis. J. Invest. Dermatol. 133 (2), 303-315 (2013).
- Gudjonsson, J. E., Johnston, A., Dyson, M., Valdimarsson, H., & Elder, J. T. Mouse models of psoriasis. J. Invest. Dermatol. 127 (6), 1292-1308 (2007).
- Malachowa, N., Kobayashi, S. D., Braughton, K. R., & DeLeo, F. R. Mouse Models of Innate Immunity. Mouse Models of Innate Immunity: Methods and Protocols. 1031, 109-116 (2013).
- Mackay, L. K. et al. Cutting Edge: CD69 Interference with Sphingosine-1-Phosphate Receptor Function Regulates Peripheral T Cell Retention. J. Immun. 194, 2059-2063 (2015).
- Schaerli, P. et al. A skin-selective homing mechanism for human immune surveillance T cells. J. Exp. Med. 199 (9), 1265-1275 (2004).
- Zaid, A. et al. Persistence of skin-resident memory T cells within an epidermal niche. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111 (14), 5307-12 (2014).
- Harris, J. E., Harris, T. H., Weninger, W., Wherry, E. J., Hunter, C. A., & Turka, L. A. A mouse model of vitiligo with focused epidermal depigmentation requires IFN-Γ for autoreactive CD8+ T cell accumulation in the skin. J. Invest. Dermatol. 132 (7), 1869-1876 (2012).
- Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., & Bosio, A. Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator. J. Vis. Exp. (22), e1029 (2008).
- Nagao, K. et al.Murine epidermal Langerhans cells and langerin-expressing dermal dendritic cells are unrelated and exhibit distinct functions. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 3312-3317 (2009).
- Pennartz, S., Reiss, S., Biloune, R., Hasselmann, D., & Bosio, A. Generation of single-cell suspensions from mouse neural tissue. J. Vis. Exp. (29), e1267 (2009).
- Dudeck, A. et al. Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens. Immunity. 34 (6), 973-84 (2011).
- Hershko, A. Y. et al. Mast Cell Interleukin-2 Production Contributes to Suppression of Chronic Allergic Dermatitis. Immunity. 35 (4), 562-571 (2011).
- Huang, H.-L. et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J. Biomed. Sci. 17, 36 (2010).
- Tabatabaei, M. et al. Isolation and partial characterization of human amniotic epithelial cells: The effect of trypsin. Avicenna J Med. Biotechnol. 6 (1), 10-20 (2014).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., & Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur. J. Microbiol. Immunol. 2, 112-120 (2012).
- Gu, D., Fan, Q., & Xie, J. Cell population analyses during skin carcinogenesis. J. Vis. Exp.(78), e50311 (2013).
- Broggi, M. A. S., Schmaler, M., Lagarde, N., & Rossi, S. W. Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells. J. Vis. Exp.(90), e51803 (2014).
- Martinov, T. et al. Contact hypersensitivity to oxazolone provokes vulvar mechanical hyperalgesia in mice. PloS one. 8 (10), e78673 (2013).
- Katsares, V. et al. A Rapid and Accurate Method for the Stem Cell Viability Evaluation: The Case of the Thawed Umbilical Cord Blood. Lab. Med. 40 (9), 557-560 (2009).
- Thomas, M. L., & Lefrançois, L. Differential expression of the leucocyte-common antigen family. Immunol. Today. 9 (10), 320-326 (1988).
- Daley, J. M., Thomay, A. A., Connolly, M. D., Reichner, J. S., & Albina, J. E. Use of Ly6G-specific monoclonal antibody to deplete neutrophils in mice. J. Leukoc. Biol. 83 (1), 64-70 (2008).
