Flow-modello Fabrication guidata della alta densità di codici a barre anticorpo Microarray
Summary
Questo protocollo descrive la fabbricazione di una grande scala, DNA o anticorpi array bidimensionale multiplato, con potenziali applicazioni in studi di segnalazione cellulare e rilevazione biomarker.
Abstract
Antibody microarray as a well-developed technology is currently challenged by a few other established or emerging high-throughput technologies. In this report, we renovate the antibody microarray technology by using a novel approach for manufacturing and by introducing new features. The fabrication of our high-density antibody microarray is accomplished through perpendicularly oriented flow-patterning of single stranded DNAs and subsequent conversion mediated by DNA-antibody conjugates. This protocol outlines the critical steps in flow-patterning DNA, producing and purifying DNA-antibody conjugates, and assessing the quality of the fabricated microarray. The uniformity and sensitivity are comparable with conventional microarrays, while our microarray fabrication does not require the assistance of an array printer and can be performed in most research laboratories. The other major advantage is that the size of our microarray units is 10 times smaller than that of printed arrays, offering the unique capability of analyzing functional proteins from single cells when interfacing with generic microchip designs. This barcode technology can be widely employed in biomarker detection, cell signaling studies, tissue engineering, and a variety of clinical applications.
Introduction
Microarrays dell'anticorpo sono stati ampiamente utilizzati in studi di proteomica per decenni per esaminare la presenza di proteine mirate, tra cui proteine biomarcatori 1-3. Anche se questo campo è attualmente di fronte a grandi sfide da altre tecnologie high-throughput come la spettrometria di massa (MS), c'è ancora molto spazio per l'utilità di microarrays dell'anticorpo, soprattutto perché questi dispositivi offrono semplice interpretazione dei dati e facile interfaccia con altri test. Negli ultimi anni, l'integrazione dei microarrays in ponteggi microchip ha fornito microarray anticorpo una nuova opportunità di prosperare 4-7. Ad esempio, il codice a barre microarray integrato in un microchip monocellulare è stato usato in studi di comunicazione cellulare 8,9. Questa tecnologia presenta notevoli vantaggi rispetto ad altre tecnologie microarray disponibili. È dotato di elementi di un array a 10-100 micron, molto più piccolo del tipico 150 micron dimensioni utilizzate in elemen microarray convenzionalits. La costruzione di elementi di un array più piccoli si ottiene utilizzando approcci sistematici flusso-patterning, e questo dà luogo a microarray compatti in grado di rilevare le proteine unicellulare secrete e proteine intracellulari. Un altro vantaggio è l'uso di una installazione senza strumento semplice. Ciò è particolarmente importante, perché la maggior parte dei laboratori e piccole imprese non siano in grado di accedere ai servizi di base di microarray. Microarrays dell'anticorpo Tale funzione avanzata di codici a barre di throughput test e possono essere utilizzati per eseguire analisi altamente multiplex su singole cellule, raggiungendo un'elevata sensibilità e specificità paragonabile a quella del convenzionale immunosorbent assay panino enzyme-linked (ELISA 8). Questa tecnologia ha trovato numerose applicazioni nel rilevare proteine da glioblastoma 9-11, le cellule T 12, e cellule tumorali circolanti 13. In alternativa, microarray di DNA barcode sola sono stati utilizzati nel posizionamento preciso dei neuroni e astrociti per Mimickzione l'assemblea in vivo del tessuto cerebrale 14.
Questo protocollo si concentra solo sui gradini sperimentali e blocchi di accumulo di bidimensionale (2-D) del codice a barre microarray anticorpo che ha potenziali applicazioni nel rilevamento dei biomarcatori in campioni fluidici e in singole cellule. La tecnologia è basata su un indirizzabile a singolo filamento, unidimensionale (1-D) microarray DNA costruite con oligonucleotidi ortogonali che sono modellate spazialmente su substrati di vetro. Il modello 1-D si forma quando i canali di flusso paralleli sono utilizzati nel passaggio di flusso-patterning, e un tale modello appare come bande discrete visivamente simili a 1-D Universal Product Code (UPC) di codici a barre. La costruzione di una matrice 2-D anticorpi (n x m) – ricorda un codice a matrice 2-D Quick Response (QR) – richiede strategie patterning più complesse, ma permette l'immobilizzazione di anticorpi ad una densità più alta 8,15. La fabbricazionerichiede due fasi patterning DNA, con il primo pattern perpendicolari al secondo. I punti di intersezione di questi due modelli costituiscono i n x m elementi della matrice. Selezionando strategicamente le sequenze di DNA a singola elica (ssDNA) utilizzati in flow-patterning, ogni elemento in un dato array viene assegnato un indirizzo specifico. Questo riferimento spaziale è necessario distinguere tra segnali di fluorescenza sul vetrino microarray. L'array ssDNA viene convertito in un array di anticorpi attraverso l'incorporazione di coniugati DNA-anticorpo complementari, formando una piattaforma chiamata biblioteca anticorpi DNA-codificato (DEAL 16).
Questo protocollo video descrive i passaggi chiave nella creazione di array nxm anticorpi che comprendono la preparazione di polidimetilsilossano (PDMS) stampi di codici a barre, flow-patterning ssDNA in due orientamenti, la preparazione di anticorpi coniugati oligonucleotide DEAL, e convertendo l'array 3 x 3 DNA in una 3x 3 matrice anticorpo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Disegno del modello di flusso è il primo passo fondamentale per fabbricare microarray 2-D. Per generare due sovrapposti pattern di DNA su un substrato di vetro, le caratteristiche di canale del primo progetto devono essere perpendicolari a quelle del secondo (Figura 1A-B). I disegni considerano anche le applicazioni a valle del microarray. Nel caso di analisi singola cella, il microarray è utilizzato per rilevare proteine da cellule singole racchiusi in microchambers, quindi le dimensio…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge the startup fund from SUNY Albany and the access of facilities at the University at Albany Cancer Research Center.
Materials
| Sylgard 184 silicone elastomer base | Dow Corning | 3097366-1004 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer curing agent | Dow Corning | 3097358-1004 | |
| SU-8 2025 photoresist | MicroChem | Y111069 | |
| Silicon wafers | University Wafers | 452 | |
| Poly-L-lysine coated glass slides | Thermo Scientific | C40-5257-M20 | |
| Oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | *Custom-ordered from Integrated DNA Technologies, see table below | |
| Poly-L-lysine adhesive stock solution | Newcomer Supply | 1339 | |
| Bis (sulfosuccinimidyl) suberate (BS3) | Thermo Scientific | 21585 | |
| 1x Phosphate buffered saline, pH 7.4 | Quality Biological | 114-058-101 | |
| Äkta Explorer 100 Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) System | GE (Amersham Pharmacia) | 18-1112-41 | |
| Superose 6 10/300 GL column | GE Healthcare Life Sciences | 17-5172-01 | |
| Capture antibodies | various | various | *Antibody selection depends on application |
| Succinimidyl-6-hydrazino-nicotinamide (S-HyNic) | Solulink | S-1002 | |
| Succinimidyl-4-formylbenzamide (S-4FB) | Solulink | S-1004 | |
| N,N-dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 227056 | |
| Citric acid, anhydrous | Acros | 42356 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318 | |
| Amicon Ultra spin filter 10 kDa MWCO | EMD Millipore | UFC201024 | |
| Spin coater | Laurell Technologies | WS-650-MZ | |
| Biopsy punch with plunger (0.50 mm diameter) | Electron Microscopy Sciences | 57393 | |
| Diamond scribe (Style 60) | SPI supplies | 6004 | |
| Trimethylchlorosilane | Sigma Aldrich | 92361 |
Riferimenti
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