Modellazione chemioterapia leucemia resistente<em&gt; In Vitro</em

Sommario

Il presente rapporto riassume un protocollo che può essere utilizzato per modellare l'influenza della nicchia del microambiente del midollo osseo sulle cellule leucemiche con particolare attenzione all'arricchimento della sottopopolazione più chemioresistente.

Abstract

È ben noto che il microambiente del midollo osseo fornisce un sito unico di santuario per le malattie ematopoietiche che iniziano e progrediscono in questo sito. Il modello presentato nel presente rapporto utilizza cellule stromali primarie del midollo osseo umano e osteoblasti come due tipi di cellule rappresentative della nicchia del midollo che influenzano il fenotipo delle cellule tumorali. Le condizioni di co-coltura in vitro descritte per le cellule leucemiche umane con questi componenti primari di nicchia supportano la generazione di una sottopopolazione chemioresistente di cellule tumorali che può essere recuperata in modo efficiente dalla coltura per l'analisi con diverse tecniche. Un rigoroso programma di alimentazione per prevenire i flussi di nutrienti seguito dal recupero delle particelle di destrano reticolato (G10) su gel di tipo 10 della popolazione di cellule tumorali che sono migrate sotto le cellule stromali aderenti del midollo osseo (BMSC) o degli osteoblasti (OB) generando una popolazione di cellule tumorali "phase dim" (PD), fornisce una fonte costante di cellule leucemiche purificate resistenti alla terapia. Questa popolazione di cellule tumorali clinicamente rilevante può essere valutata con metodi standard per studiare le vie di regolazione apoptotica, metabolica e del ciclo cellulare, oltre a fornire un obiettivo più rigoroso in cui testare nuove strategie terapeutiche prima di indagini precliniche mirate alla malattia residua minima.

Introduzione

L'obiettivo generale del metodo descritto è quello di fornire un approccio in vitro efficiente ed economico che supporti lo studio dei meccanismi che sono alla base della sopravvivenza delle cellule leucemiche supportate dal midollo osseo durante l'esposizione alla chemioterapia. È ben documentato che le cellule tumorali residue sopravvissute che persistono dopo il trattamento contribuiscono alla recidiva della malattia che è spesso più aggressiva di quella alla diagnosi ed è spesso trattata in modo meno efficace^1-8. I modelli che includono cellule leucemiche in isolamento, come quelli limitati alla coltura di cellule in soli terreni, per la sperim....

Protocollo

1. Preparazione avanzata

1. Preparazione particelle G10 destrano.
   1. Preparare G10 impasto con l'aggiunta di 50 ml di PBS 1X a 10 particelle g G10. Mescolare per inversione e consentire G10 a stabilirsi fuori tampone fosfato (PBS) a 4 ° CO / N.
   2. Il giorno del G10 di separazione colonna, aspirare PBS dalle particelle del G10 stanziali e aggiungere 50 ml di PBS fresco. Mescolare per inversione. Ripetere due volte, aggiungendo 50 ml PBS fresco di particelle G10 stabiliti e conservare a 4 ° C fino al momento dell'uso.
2. Coltura BMSC e OB.
   1. Mantenere sia BMSC o OB a 37 ° C in 6% CO _{2 e} coltivati ​​su 10 c....

Risultati

L'installazione di successo e la cultura di questo modello di co-coltura comporterà la creazione di 3 sottopopolazioni di cellule leucemiche relativi alla aderenti BMSC o OB monostrato. Figura 1 mostra come tutte le cellule seminate in un monostrato BMSC appaiono inizialmente come una sola popolazione di sospensione cellule leucemiche. Nel corso di 4 giorni cellule leucemiche interagiscono con il BMSC per formare 3 sottopopolazioni spaziali di cellule leucemiche (sos.......

Discussione

malattia residua minima (MRD) che contribuisce alla ricaduta della malattia continua ad essere una sfida clinica nel trattamento aggressivo refrattario ALL, nonché una serie di altre neoplasie ematologiche. Il microambiente del midollo osseo è il sito più comune di recidiva in ALL ^3,8. In quanto tale, i modelli che modellano il microambiente del midollo osseo sono strumenti essenziali per testare ipotesi legate alla sopravvivenza delle cellule tumorali leucemiche e manutenzione di MRD durante l'esposizion.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Perline di sephadex G10	Sigma	G10120	Indicato nel manoscritto come gel tipo 10 particelle di destrano reticolato
Siringa sterile da 10 ml	BD	309604
Lana di vetro	Pyrex	3950
Rubinetti a 1 via	World Precision Instruments, Inc.	14054-10
Provette da centrifuga coniche da 50 ml	medici mondiali	41021039	Utilizzato come provette
da centrifuga coniche da 15 ml	medici mondiali	41021037	Utilizzato per la raccolta di cellule
Siero bovino fetale	Sigma	F6178
0,05% Tripsina	Mediatech, Inc.	25-053-CI
100 x 20 mm Piastre per colture cellulari	Greiner Bio-One	664160<
strong>Terreni di coltura
Terreni di coltura per osteoblasti	PromoCell	C-27001	Per terreni di osteoblasti umani
RPMI 1640 media	Mediatech, Inc.	15-040	Per la preparazione dei terreni tumorali
Linee cellulari
Cellule aderenti:
Osteoblasti umani	PromoCell	C-12720	L'osteoblasto umano è stato coltivato secondo il fornitore" s raccomandazioni.
Cellule stromali di Morrow osseo umano	umano WVU Biospecimen Core		Leucemia umana primaria de-identificata e cellule stromali del midollo osseo (BMSC) sono state fornite dal Mary Babb Randolph Cancer Center (MBRCC) Biospecimen Processing Core e dal Dipartimento di Patologia della West Virginia University. Le colture BMSC sono state stabilite come descritto in precedenza (*)
Cellule leucemiche:
REH	ATCC	ATCC-CRL-8286	Le cellule REH sono state coltivate secondo il fornitore" s raccomandazioni e supporti consigliati.
SD-1	DSMZ	ACC 366	SD-1 sono stati coltivati secondo il fornitore' s raccomandazioni e supporti consigliati.
(*) Gibson LF, Fortney J, Landreth KS, Piktel D, Ericson SG, Lynch JP. Interruzione della funzione delle cellule stromali del midollo osseo da parte dell'etoposide. Trapianto di midollo sanguigno Biol J am Soc trapianto di midollo sanguigno. Agosto 1997; 3(3):122–32.

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