단백질 발현의 정량 분석은 마우스 착상 전의 배아에서 리니지 사양을 공부하기
Summary
이 프로토콜은 마우스 착상 전 배아 계통 명세서를 연구하는 단백질 발현의 정량적 분석 시츄, 단일 셀을 수행하는 방법을 제시한다. 포배의 수집에 필요한 절차, 단백질의 면역 검출을 전체 마운트, 공 초점 현미경, 핵 세분화 및 이미지 분석에 샘플 영상은 설명한다.
Abstract
이 프로토콜은 방법은 정량적 수행하기 위해 제공, 현장에서 단일 셀 혈통 사양을 연구하는 단백질 발현 분석 마우스 착상 전 배아에서. 배아 수집, 면역, 공 초점 현미경 영상 및 이미지 세분화 및 분석에 필요한 절차를 설명한다. 이 방법은 여러 핵 마커의 발현 및 공간 (XYZ)의 정량은 태아의 모든 셀의 좌표를 허용한다. 그것은 MINS, 특히 착상 전 배아 및 배아 줄기 세포 (ESC) 식민지의 공 초점 이미지의 분석을 위해 개발 한 이미지 분할 소프트웨어 툴을 활용합니다. 분 X, Y 및 Z 차원 걸쳐 자율 핵 세그멘테이션을 수행하고, 최소한의 사용자 입력을 모든 채널에 대해 3 차원 공간에서 셀의 위치에 대한 정보뿐만 아니라, 핵 형광 레벨을 생성한다. 이 프로토콜은 화상의 분석을 위해 최적화되어 있지만착상 전 단계의 마우스 배아, 그것은 쉽게 양호한 신호 대 잡음비 및 여기서 높은 핵 밀도 (이미지 분할에 장애물 포즈 등., 배아 줄기 세포의 발현 분석을 나타내는 임의의 다른 시료의 분석 (ESC에 적용 할 수있다 ) 식민지 문화의 셀, 다른 종 또는 단계 등)의 배아를 차별화.
Introduction
마우스 착상 전 배아 세포 운명 명세서 및 포유 동물에서 상피 새로이 연구 출현 생체 능성의 유지뿐만 아니라, 모델을 학습하는 패러다임이다. 두 배외 (extraembryonic) 계통, trophectoderm (TE)와 – 대부분의 체세포 조직 및 생식 세포에 상승을 제공 – 포유류 개발의 착상 전 단계는 배반포, 즉 만능 epiblast을 구성하는 세 가지 세포 계통의 확립에 최선을 다하고 있습니다 원시 내배엽 (예정) (그림 1A) 1,2. 이 프로토콜은, (2), 관심의 단백질을 라벨 면역 형광을 수행 (3) Z-절편 기능과 함께 공 초점 현미경을 사용하여 이미지를 마운트 전체 수행 (1) 수확 및 수정 착상 전 단계 마우스 배아에 대한 절차를 설명 (4) 공 초점 이미지와 이후의 양적 이미지 분석의 핵 분할을 수행합니다. 이 파이프 라인은 t 수 있습니다그 자리에서 세포의 개체군을 특성화 셀 아이덴티티 할당을 위해 단백질 수준을 측정 바이어스. 데이터 분석 (도 1b)에 배아 컬렉션 (일반적으로 10 마우스 배아까지) 한 쓰레기 4 일 -이 프로토콜은 적은 3로 수행 될 수있다. 여러 리터의 동시 분석에 따라서 프로토콜의 전체 길이를 연장하는, 촬상 데이터 분석 시간 부담을 증가시킨다.
착상 전 단계 마우스 배아는 작은 크기와 진부한 형태 3 제공, 단일 셀 해상도 세포 과정의 토토 영상에 적합하다, 실험적으로 다루기 쉬운 시스템입니다. 배아의 통계적으로 중요한 수의 편향, 시스템 레벨 분석을 수행하는, 자동화 된 정량 분석 파이프 바람직하다. 그러나, 내부 세포괴 높은 핵 밀도의 배반포 (ICM)에 의한 ( <st룽>도 1a,도 2D), 종래의 이미지 분할 플랫폼은 자동화 또는 반 자동화 된 작업 흐름을 확립하기에 충분한 정확도를 제공하지 못한다. 한편, 수동 세분화 정확하면서 세포 및 배아 큰 집단의 처리를 허용하지 않으며, 셀 아이덴티티 재현성 편향 판에 적합 – 발달 단계를 연구 할 때 특히 중요 여기서 마커 패턴 표현은 완전히 (예를 들면, 인구에 걸쳐 진 분포를 나타내지 않는다)가 해결되지. 최소한의 사용자 입력 4-8을 필요로하는 동안 우리는 최근에, 마우스 착상 전 단계의 배아과 높은 정확도를 달성 마우스 배아 줄기 세포 (는 ESC)에 맞춰 이미지 분할 방법을 개발하고 검증했다.
여기에 제시된 분석 파이프 라인은 MATLAB 기반의 영상 분할 도구 모듈 형 인터랙티브 핵 분할 (분) (4)를 중심으로 돌아 가지. MINS 피사용자는 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI) (표 1) (4)를 이용하여, 이미지 속성의 최소 수를 설정 한 후 촛점 Z-스택 대규모 배치에서 자율 핵 분할 erforms. 이 파이프 라인은 모두 야생형 단백질의 발현 및 세포 국산화 높은 처리량 데이터의 생성 효율이 입증 된 실험적 치료 및 유전자 배아는 ESC 5-7 변성. 본 프로토콜에서, 우리는 착상 전 단계의 배아 이미지의 분할에 MINS의 응용 프로그램을 설명합니다. 는 ESC에 MINS 성능의 예를 들어 4,7 참조하십시오. 자동화 핵 분할 단계는 크게 공간 형광 세기 측정은 배아 세포 아이덴티티 바이어스 결정 및 유전자 발현 도메인 및 셀 위치의 3 차원지도를 생성 할 수있는 반면 (도를 셀 구분 처리시의 부담을 줄일 1C </strong>). 또한,이 워크 플로의 확장 성을 실험적으로 처리 된 배아, 또는 다른 유전 적 배경 5,6의 배아의 큰 집단을 통해 개별 새끼의 분석은 적용한다. 분 (소프트웨어 MATLAB 라이센스가 필요합니다) http://katlab-tools.org에서 자유롭게 사용할 수 있습니다.
현재까지 개발 된 어떤 접근 방식은 마우스 착상 전 배아의 단백질 발현 및 세포 현지화에 같은 깊이있는 데이터의 생성을 허용하지 않습니다. 모든 시도는 지금까지 이러한 유형의 데이터를 정량화 수동 판정 다른 집단에 대한 세포 수를 정량 배아 (전체가 수동으로, 또는 소프트웨어 보조 식) 9-19로 제한되어왔다. (MINS 소프트웨어를 포함)이 접근 방식에 맞춰 마우스 착상 전 배아와는 ESC에서 테스트되었습니다; 그럼에도 불구하고 높은 핵 밀도가 다른 시스템의 성능은 아직 검증되지 않은 있지만, 상당 할 것으로 예상된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
본 프로토콜은 착상 전 단계 마우스 배아에서 전체 마운트 면역의 정량 분석을 수행하는 방법을 설명합니다. 강력한 면역 프로토콜 (22)는 고해상도의 뒤에, (4)의 소프트웨어 맞춤 부재를 사용하는 공 초점 이미지 및 이미지 분할을하여 전체를 실장. 면역 프로토콜의 선택은 중요하지 않지만, 우리는 빠르고 안정적으로 우리는 시험 한 항체의 많은 강력한 신호를 제공하기 위?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Stefano Di Talia, Alberto Puliafito, Venkatraman Seshan and Panagiotis Xenopoulos, for input on data handling, analysis and representation, Berenika Plusa for assistance in the design of the immunofluorescence protocol and antibody testing and members of the Hadjantonakis lab for comments on the manuscript and on the development of this protocol. Work in our lab is supported by the National Institutes of Health R01-HD052115 and R01-DK084391, and by NYSTEM N13G-236.
Materials
| Embryo collection | |||
| Blunt probe for plug checking | Roboz | RS-9580 | |
| Forceps | Roboz | RS-4978 | |
| Surgery scissors | Roboz | RS-5910 | |
| Glass Pasteur pipettes | Fisher | 13-678-20C | |
| Pre-assembled aspirator tube & mouthpiece | Sigma | A5177 | |
| Longer rubber tubing | Fisher | 14-178-2AA | |
| M2 | Millipore | MR-015-D | |
| FHM | Millipore | MR-024-D | |
| Acid Tyrode's solution | Millipore | MR-004-D | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 | |
| 4-well plates | Nunc/Thermo-Fisher | 12-566-300 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunofluorescence | |||
| 96-well U-bottom plates | Fisher | 14-245-73 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Glycine | Sigma | G7403 | |
| Horse serum | Sigma | H0146 | |
| Primary antibodies | Concentration | ||
| CDX2 | Biogenex | AM392-5M | 1:200 |
| GATA6 | R&D | AF1700 | 1:100 |
| GATA4 | Santa Cruz | sc-9053 | 1:100, 10 min fixation |
| GATA4 | Santa Cruz | sc-1237 | 1:100, overnight fixation |
| SOX17 | R&D | AF1924 | 1:100 |
| Nanog | ReproCELL | RCAB0002P-F | 1:500 |
| OCT4 | Santa Cruz | sc-5279 | 1:100, 10 min to overnight fixation |
| DAB2 | BD | BD-610464 | 1:200 |
| Secondary antibodies | Life Technologies | Various | 1:500 |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Imaging | |||
| 35 mm glass-bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Segmentation | |||
| Computer running 64-bit Windows OS | n/a | Verify minimal system requirements at http://katlab-tools.org and in Lou et al., (2014) Stem Cell Reports | |
| MATLAB (software) | Mathworks | n/a | |
| MINS (software) | Free | n/a | http://katlab-tools.org |
Riferimenti
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