Kvantitativ analyse af Protein Expression til Studieinformationen Lineage Specification i Mouse præimplantationsperioden Embryoner
Summary
Denne protokol viser en metode til at udføre kvantitativ, encellede in situ analyse af proteinekspression at studere afstamning specifikation i mus præimplantations embryoer. De procedurer, der er nødvendige til indsamling af blastocyster, hel-mount immunofluorescent påvisning af proteiner, er billeddannelse af prøver på en konfokal mikroskop, og nuklear segmentering og billedanalyse beskrevet.
Abstract
Denne protokol viser en metode til at udføre kvantitativ, encellede in situ analyser af proteinekspression at studere afstamning specifikation i muse præimplantations embryoer. De nødvendige procedurer for embryonindsamlingsteam, immunofluorescens, billedbehandling på en konfokal mikroskop, og image segmentering og analyse er beskrevet. Denne fremgangsmåde tillader kvantificering af ekspressionen af multiple nukleare markører og den rumlige (XYZ) koordinater for alle celler i embryonet. Det udnytter MINS, et billede segmentering softwareværktøj specielt udviklet til analyse af konfokale billeder af præimplantations embryoner og embryonale stamceller (ESC) kolonier. MINS udfører ukontrollerede nuklear segmentering på tværs af X, Y og Z dimensioner, og producerer information om celle position i det tredimensionale rum, samt nukleare niveauer af fluorescens for alle kanaler med minimal brugerinput. Mens denne protokol er blevet optimeret til analyse af billederaf præimplantations fase musefostre, kan det let tilpasses til analyse af andre prøver, der udviser et godt signal-støj-forhold, og hvor høj nuklear densitet udgør en forhindring for billedsegmentering (f.eks., ekspression analyse af embryonale stamceller (ESC ) kolonier, differentierende celler i kultur, embryoner af andre arter eller stadier, etc.).
Introduction
Musen præimplantationsperioden embryo er et paradigme for at studere fremkomsten og vedligeholdelse af pluripotens in vivo, såvel som en model for studiet af celle skæbne specifikation og de novo epitelialisering i pattedyr. Præimplantationsperioden stadier af pattedyrs udvikling er dedikeret til oprettelsen af de tre cellelinier, der udgør blastocyst, nemlig pluripotente epiblasten – hvilket giver anledning til de fleste somatiske væv og kimceller – og to extraembryonic slægter, den trophectoderm (TE) og primitive endoderm (pRE) (figur 1A) 1,2. Denne protokol beskriver procedurer til (1) høst og løse præimplantationsperioden etape musefostre, (2) udføre immunofluorescens at mærke proteiner af interesse, (3) udføre hel-mount billeddannelse ved hjælp af en konfokal mikroskop med z-sektionering evner og (4) udføre nukleare segmentering af konfokale billeder og efterfølgende kvantitativ billede analyser. Denne rørledning tillader than uvildig måling af protein niveauer for tildeling af celle identiteter til at karakterisere subpopulationer af celler in situ. Denne protokol kan gennemføres i så lidt som 3 – 4 dage for en enkelt kuld (generelt op til 10 musefostre), fra embryonindsamlings- til dataanalyse (figur 1B). Den samtidige analyse af flere kuld vil øge billedbehandling og dataanalyse tid byrde, hvilket forlænger den samlede længde af protokollen.
Den præimplantationsperioden fase mus embryo er et eksperimentelt medgørlig system, som på grund af sin lille størrelse og stereotype morfologi 3, er velegnet til i toto billeddannelse af cellulære processer med enkelt-celle opløsning. For at udføre en fordomsfri, systemer-niveau analyse af et statistisk relevant antal embryoner, en automatiseret, kvantitativ analyse pipeline er ønskelig. Men på grund af den høje nukleare tæthed af den indre cellemasse (ICM) af blastocyst ( <stRong> Figur 1A, 2D), traditionelle billede segmentering platforme undlader at give tilstrækkelig nøjagtighed til at etablere en automatiseret eller semi-automatiske workflow. På den anden side, manuel segmentering, mens nøjagtige, tillader ikke behandling af store kohorter af celler og embryoer, er heller ikke egnet til en reproducerbar, unbiased bestemmelse af celle identiteter – som er særligt kritisk, når man undersøger udviklingsstadier hvor mønstre af markør udtryk har ikke helt løst (f.eks ikke udviser en binær fordeling på tværs af en population). Vi har for nylig udviklet og valideret et billede segmentering metode skræddersyet til mus præimplantations embryoer og for mus embryonale stamceller (EKSF), der opnår høj nøjagtighed, mens kræver minimal brugerinput 4-8.
Analysen pipeline præsenteres her kredser om MATLAB-baserede image segmentering værktøj Modular Interactive Nuclear Segmentering (minutter) 4. MINS performs uovervåget nukleare segmentering på store partier af konfokal Z-stakke, efter at brugeren har etableret et minimalt antal billedegenskaber, ved hjælp af en grafisk brugergrænseflade (GUI) (tabel 1) 4. Denne rørledning har vist effektiv til generering af højkapacitets data om proteinekspression og celle lokalisering i både vildtype, eksperimentelt behandlede og genetisk modificerede embryoner og ESC 5-7. I nærværende protokol, beskriver vi anvendelsen af minutter til segmentering af præimplantationsperioden-trins embryo billeder. For eksempler på MINS ydeevne på økonomiske og sociale råd henvises til 4,7. Den automatiserede nukleare segmentering trin reducerer den tid, byrden af identifikation celle processen, mens de rumlige og fluorescens målinger intensitet tillade en uvildig bestemmelse af celle identiteter og generering af tredimensionelle kort over genekspression domæner og celle position i fosteret (figur 1C </strong>). Desuden skalerbarhed af denne arbejdsgang gør den anvendelig til analyse af de enkelte kuld gennem store kohorter af eksperimentelt behandlede embryoner eller embryoner af forskellige genetiske baggrunde 5,6. MINS er frit tilgængelige på http://katlab-tools.org (softwaren kræver en MATLAB licens).
Ingen tilgang udviklet til dato giver mulighed generation af sådanne dybdegående data om proteinekspression og celle lokalisering i mus præimplantations embryoer. Alle forsøg hidtil på at kvantificere disse typer af data er blevet begrænset til den manuelle beslutsomhed og kvantificering af celle numre til forskellige populationer i fosteret (enten helt manuelt eller software-assisteret) 9-19. Denne tilgang (indarbejde MINS software) er blevet skræddersyet til og testet på mus præimplantations embryoner og økonomiske og sociale råd; alligevel dens ydeevne på andre systemer med høj nukleare tæthed, selv om endnu uprøvet, forventes at være tilsvarende.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den nuværende protokol beskriver en metode til at udføre en kvantitativ analyse af hel-mount immunfluorescens på præimplantations scene museembryoer. En robust immunofluorescens protokol 22 efterfølges af høj opløsning, hel-mount konfokal billeddannelse og ved billedanalyse segmentering ved anvendelse af en skræddersyet stykke software 4. Mens valget af immunfluorescens-protokol er ikke kritisk, finder vi en præsenteres her 22 at være hurtig, pålidelig og at tilvejebringe robu…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Stefano Di Talia, Alberto Puliafito, Venkatraman Seshan and Panagiotis Xenopoulos, for input on data handling, analysis and representation, Berenika Plusa for assistance in the design of the immunofluorescence protocol and antibody testing and members of the Hadjantonakis lab for comments on the manuscript and on the development of this protocol. Work in our lab is supported by the National Institutes of Health R01-HD052115 and R01-DK084391, and by NYSTEM N13G-236.
Materials
| Embryo collection | |||
| Blunt probe for plug checking | Roboz | RS-9580 | |
| Forceps | Roboz | RS-4978 | |
| Surgery scissors | Roboz | RS-5910 | |
| Glass Pasteur pipettes | Fisher | 13-678-20C | |
| Pre-assembled aspirator tube & mouthpiece | Sigma | A5177 | |
| Longer rubber tubing | Fisher | 14-178-2AA | |
| M2 | Millipore | MR-015-D | |
| FHM | Millipore | MR-024-D | |
| Acid Tyrode's solution | Millipore | MR-004-D | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 | |
| 4-well plates | Nunc/Thermo-Fisher | 12-566-300 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunofluorescence | |||
| 96-well U-bottom plates | Fisher | 14-245-73 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Glycine | Sigma | G7403 | |
| Horse serum | Sigma | H0146 | |
| Primary antibodies | Concentration | ||
| CDX2 | Biogenex | AM392-5M | 1:200 |
| GATA6 | R&D | AF1700 | 1:100 |
| GATA4 | Santa Cruz | sc-9053 | 1:100, 10 min fixation |
| GATA4 | Santa Cruz | sc-1237 | 1:100, overnight fixation |
| SOX17 | R&D | AF1924 | 1:100 |
| Nanog | ReproCELL | RCAB0002P-F | 1:500 |
| OCT4 | Santa Cruz | sc-5279 | 1:100, 10 min to overnight fixation |
| DAB2 | BD | BD-610464 | 1:200 |
| Secondary antibodies | Life Technologies | Various | 1:500 |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Imaging | |||
| 35 mm glass-bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Segmentation | |||
| Computer running 64-bit Windows OS | n/a | Verify minimal system requirements at http://katlab-tools.org and in Lou et al., (2014) Stem Cell Reports | |
| MATLAB (software) | Mathworks | n/a | |
| MINS (software) | Free | n/a | http://katlab-tools.org |
Riferimenti
- Saiz, N., Plusa, B. Early cell fate decisions in the mouse embryo. Reproduction. 145 (3), R65-R80 (2013).
- Schrode, N., Xenopoulos, P., Piliszek, A., Frankenberg, S., Plusa, B., Hadjantonakis, A. -. K. Anatomy of a blastocyst: cell behaviors driving cell fate choice and morphogenesis in the early mouse embryo. Genesis. 51 (4), 219-233 (2013).
- Saiz, N., Plusa, B., Hadjantonakis, A. -. K. Single cells get together: High-resolution approaches to study the dynamics of early mouse development. Seminars in cell & developmental biology. , (2015).
- Lou, X., Kang, M., Xenopoulos, P., Muñoz-Descalzo, S., Hadjantonakis, A. -. K. A Rapid and Efficient 2D/3D Nuclear Segmentation Method for Analysis of Early Mouse Embryo and Stem Cell Image Data. Stem Cell Reports. 2 (3), 382-397 (2014).
- Le Bin, G. C., Muñoz-Descalzo, S., et al. Oct4 is required for lineage priming in the developing inner cell mass of the mouse blastocyst. Development. 141 (5), 1001-1010 (2014).
- Schrode, N., Saiz, N., Di Talia, S., Hadjantonakis, A. -. K. GATA6 Levels Modulate Primitive Endoderm Cell Fate Choice and Timing in the Mouse Blastocyst. Developmental Cell. 29 (4), 454-467 (2014).
- Xenopoulos, P., Kang, M., Puliafito, A., Di Talia, S., Hadjantonakis, A. -. K. Heterogeneities in Nanog Expression Drive Stable Commitment to Pluripotency in the Mouse Blastocyst. Cell Reports. 10 (9), 1508-1520 (2015).
- Saiz, N., Kang, M., et al. Quantitative analyses for elucidating mechanisms of cell fate commitment in the mouse blastocyst. Proceedings of SPIE. 9334, (2015).
- Fleming, T. P. A quantitative analysis of cell allocation to trophectoderm and inner cell mass in the mouse blastocyst. Developmental biology. 119 (2), 520-531 (1987).
- Dietrich, J. -. E., Hiiragi, T. Stochastic patterning in the mouse pre-implantation embryo. Development. 134 (23), 4219-4231 (2007).
- Plusa, B., Piliszek, A., Frankenberg, S., Artus, J., Hadjantonakis, A. -. K. Distinct sequential cell behaviours direct primitive endoderm formation in the mouse blastocyst. Development. 135 (18), 3081-3091 (2008).
- Gerbe, F., Cox, B., Rossant, J., Chazaud, C. Dynamic expression of Lrp2 pathway members reveals progressive epithelial differentiation of primitive endoderm in mouse blastocyst. Developmental biology. 313 (2), 594-602 (2008).
- Nichols, J., Silva, J., Roode, M., Smith, A. Suppression of Erk signalling promotes ground state pluripotency in the mouse embryo. Development. 136 (19), 3215-3222 (2009).
- Yamanaka, Y., Lanner, F., Rossant, J. FGF signal-dependent segregation of primitive endoderm and epiblast in the mouse blastocyst. Development. 137 (5), 715-724 (2010).
- Morris, S. A., Teo, R. T. Y., Li, H., Robson, P., Glover, D. M., Zernicka-Goetz, M. Origin and formation of the first two distinct cell types of the inner cell mass in the mouse embryo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (14), 6364-6369 (2010).
- Artus, J., Panthier, J. -. J., Hadjantonakis, A. -. K. A role for PDGF signaling in expansion of the extra-embryonic endoderm lineage of the mouse blastocyst. Development. 137 (20), 3361-3372 (2010).
- Artus, J., Piliszek, A., Hadjantonakis, A. -. K. The primitive endoderm lineage of the mouse blastocyst: Sequential transcription factor activation and regulation of differentiation by Sox17. Developmental biology. 350 (2), 393-404 (2011).
- Kang, M., Piliszek, A., Artus, J., Hadjantonakis, A. -. K. FGF4 is required for lineage restriction and salt-and-pepper distribution of primitive endoderm factors but not their initial expression in the mouse. Development. 140 (2), 267-279 (2013).
- Bessonnard, S., De Mot, L., et al. Gata6, Nanog and Erk signaling control cell fate in the inner cell mass through a tristable regulatory network. Development. 141 (19), 3637-3648 (2014).
- Behringer, R. R., Gertsenstein, M., Vintersten Nagy, K., Nagy, A. . Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual. , (2014).
- Czechanski, A., Byers, C., et al. Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains. Nature Protocols. 9 (3), 559-574 (2014).
- Frankenberg, S., Shaw, G., Freyer, C., Pask, A. J., Renfree, M. B. Early cell lineage specification in a marsupial: a case for diverse mechanisms among mammals. Development. 140, 965-975 (2013).
- Artus, J., Vandormael-Pournin, S., Frödin, M., Nacerddine, K., Babinet, C., Cohen-Tannoudji, M. Impaired mitotic progression and preimplantation lethality in mice lacking OMCG1, a new evolutionarily conserved nuclear protein. Molecular and cellular biology. 25 (14), 6289-6302 (2005).
- Saiz, N., Grabarek, J. B., Sabherwal, N., Papalopulu, N., Plusa, B. Atypical protein kinase C couples cell sorting with primitive endoderm maturation in the mouse blastocyst. Development. 140 (21), 4311-4322 (2013).
