Kwantitatieve Analyse van eiwitexpressie aan Lineage Specificatie studie in muizenmodellen preimplantatie embryo's
Summary
Dit protocol geeft een werkwijze kwantitatieve eencellige voeren in situ analyse van eiwitexpressie van afstamming specificatie mouse pre-implantatie embryo bestuderen. De noodzakelijke voor het verzamelen van blastocysten procedures, whole-mount immunofluorescentie detectie van eiwitten, beeldvorming van de monsters op een confocale microscoop, en nucleaire segmentatie en beeldanalyse worden beschreven.
Abstract
Dit protocol geeft een methode om kwantitatieve voeren, eencellige in situ analyse van eiwitexpressie van afstamming specificatie bestuderen in de muis pre-implantatie embryo's. De voor het embryo, immunofluorescentie, imaging op een confocale microscoop, en het beeld segmentatie en analyse procedures worden beschreven. Deze werkwijze maakt kwantificering van de expressie van meerdere nucleaire markers en de ruimtelijke (XYZ) coördinaten van alle cellen in de embryo. Het maakt gebruik van MINS, een beeld segmentatie software tool speciaal ontwikkeld voor de analyse van confocale beelden van pre-implantatie embryo's en embryonale stamcellen (ESC) kolonies. MIN voert onbewaakte nucleaire segmentatie de X, Y en Z dimensies en verschaft informatie over de mobiele positie in de driedimensionale ruimte, en nucleaire fluorescentie niveaus voor alle kanalen met minimale gebruikersinvoer. Hoewel dit protocol is geoptimaliseerd voor de beeldanalysevan pre-implantatie fase muizenembryo's, kan het gemakkelijk worden aangepast aan de analyse van elke andere monsters vertonen een goede signaal-ruisverhouding en waar hoge nucleaire dichtheid vormt een hindernis voor beeldsegmentatie (bijv., expressie analyse van embryonale stamcel (ESC ) kolonies, differentiërende cellen in kweek, embryo's van andere species of trappen, etc.).
Introduction
De muis pre-implantatie embryo een paradigma voor het ontstaan en behoud van pluripotentie in vivo, evenals als model voor de studie die het lot specificatie en de novo epithelialisatie bij zoogdieren te bestuderen. De pre-implantatie stadia van de ontwikkeling van zoogdieren zijn toegewijd aan de oprichting van de drie cellijnen die deel uitmaken van de blastocyst, namelijk de pluripotente epiblast – en twee extra-embryonale lijnen, de trophectoderm (TE) en de – die heeft geleid tot de meeste somatische weefsels en kiemcellen geeft primitieve endoderm (pre) (Figuur 1A) 1,2. Dit protocol beschrijft de procedures om (1) de oogst en bevestig pre-implantatie stadium muizenembryo's, (2) het uitvoeren van immunofluorescentie om eiwitten van belang te labelen, (3) verrichten whole-mount beeldvorming met behulp van een confocale microscoop met-z snijden mogelijkheden en (4) het uitvoeren van nucleaire segmentatie van confocale beelden en de daarop volgende beeld kwantitatieve analyses. Deze leiding maakt tHij onpartijdige meting van eiwitniveaus voor toewijzing van cel identiteiten subpopulaties van cellen in situ karakteriseren. 4 dagen om de data-analyse (Figuur 1B) voor één nest (doorgaans tot 10 muizenembryo's), van embryo – Dit protocol kan in slechts 3 worden uitgevoerd. De gelijktijdige analyse van een aantal nesten zou de beeldvorming en data-analyse tijd last te verhogen, waardoor de totale lengte van het Protocol tot verlenging.
De pre-implantatie stadium muizenembryo is een experimenteel handelbaar systeem dat, gezien de geringe omvang en stereotiepe morfologie 3, is zeer geschikt voor in toto beeldvorming van cellulaire processen met single-cell resolutie. Om een onbevooroordeelde, systems-niveau analyse van een statistisch relevant aantal embryo's uit te voeren, een geautomatiseerde, kwantitatieve analyse pipeline is wenselijk. Echter, vanwege de hoge nucleaire dichtheid van de binnenste celmassa (ICM) van de blastocyst ( <strong> Figuur 1A, 2D), conventionele image segmentatie platforms niet aan voldoende nauwkeurigheid om een geautomatiseerde of semi-geautomatiseerde workflow vestigen. Anderzijds, handmatige segmentatie nauwkeurig, maar niet de verwerking van grote cohorten van cellen en embryo toelaten, noch is het geschikt om reproduceerbare onpartijdige bepaling van cel identiteiten – wat vooral van belang bij de studie ontwikkelingsstadia waar het patroon van marker meningsuiting nog niet volledig opgelost (bijvoorbeeld, doe een binaire verdeling over een populatie vertonen). We hebben onlangs ontwikkeld en gevalideerd een beeld segmentatie methode op maat gemaakt voor de muis pre-implantatie embryo's en muis embryonale stamcellen (SER), die een hoge nauwkeurigheid bereikt, terwijl die een minimale input van de gebruiker 4-8.
De analyse pipeline hier gepresenteerde draait om de MATLAB-gebaseerde beeld segmentatietool Modular Interactive Nuclear Segmentation (minuten) 4. MINS performs onbewaakte nucleaire segmentatie op grote hoeveelheden confocale Z-stacks nadat de gebruiker zo min mogelijk beeld eigenschappen heeft vastgesteld met behulp van een grafische gebruikersinterface (GUI) (Tabel 1) 4. Deze pijplijn is efficiënt gebleken voor het genereren van hoge doorvoer gegevens eiwitexpressie en cellen lokalisatie in zowel wildtype experimenteel behandelde en genetisch gemodificeerde embryo en SER 5-7. In het huidige protocol beschrijven we de toepassing van minuten naar de segmentatie van pre-implantatie-embryo stadium beelden. Voor voorbeelden van MINS prestaties op sociaal-economische raden verwijzen wij u naar 4,7. De geautomatiseerde nucleaire segmentatie stap vermindert de tijd last van de cel identificatieproces, terwijl de ruimtelijke en fluorescentie-intensiteit metingen laten een onbevooroordeelde bepaling van cel identiteiten en het genereren van driedimensionale kaarten van genexpressie domeinen en celpositie in het embryo (Figuur 1C </strong>). Bovendien is de schaalbaarheid van deze werkstroom maakt het voor die analyse van afzonderlijke nesten door grote cohorten van experimenteel behandelde embryo of embryo's van verschillende genetische achtergronden 5,6. MINS is vrij beschikbaar op http://katlab-tools.org (de software vereist een MATLAB-licentie).
Geen aanpak ontwikkeld tot op heden staat de vorming van dergelijke diepgaande gegevens over eiwit expressie en cel lokalisatie in de muis pre-implantatie embryo's. Alle pogingen tot nu toe bij het kwantificeren van dit soort gegevens zijn beperkt tot het handmatig bepalen en kwantificering van de mobiele nummers voor verschillende populaties in het embryo (hetzij geheel handmatig of software-geassisteerde) 9-19. Deze benadering (integratie van MINS software) is op maat gemaakt voor en getest op de muis pre-implantatie embryo's en SER; niettemin zijn prestaties op andere systemen met hoge dichtheid nucleaire, hoewel nog niet getest, wordt verwacht gelijkwaardig.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het huidige protocol beschrijft een methode om een kwantitatieve analyse van whole-mount immunofluorescentie voeren op pre-implantatie stadium muizenembryo's. Een robuuste immunofluorescentie protocol 22 wordt gevolgd door een hoge resolutie, whole-mount confocale imaging en image segmentatie met behulp van een op maat gesneden stukje software 4. Terwijl de keuze van immunofluorescentie protocol is niet kritisch, vinden we de hier gepresenteerde 22 snel, betrouwbaar en stabiel …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Stefano Di Talia, Alberto Puliafito, Venkatraman Seshan and Panagiotis Xenopoulos, for input on data handling, analysis and representation, Berenika Plusa for assistance in the design of the immunofluorescence protocol and antibody testing and members of the Hadjantonakis lab for comments on the manuscript and on the development of this protocol. Work in our lab is supported by the National Institutes of Health R01-HD052115 and R01-DK084391, and by NYSTEM N13G-236.
Materials
| Embryo collection | |||
| Blunt probe for plug checking | Roboz | RS-9580 | |
| Forceps | Roboz | RS-4978 | |
| Surgery scissors | Roboz | RS-5910 | |
| Glass Pasteur pipettes | Fisher | 13-678-20C | |
| Pre-assembled aspirator tube & mouthpiece | Sigma | A5177 | |
| Longer rubber tubing | Fisher | 14-178-2AA | |
| M2 | Millipore | MR-015-D | |
| FHM | Millipore | MR-024-D | |
| Acid Tyrode's solution | Millipore | MR-004-D | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 | |
| 4-well plates | Nunc/Thermo-Fisher | 12-566-300 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunofluorescence | |||
| 96-well U-bottom plates | Fisher | 14-245-73 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Glycine | Sigma | G7403 | |
| Horse serum | Sigma | H0146 | |
| Primary antibodies | Concentration | ||
| CDX2 | Biogenex | AM392-5M | 1:200 |
| GATA6 | R&D | AF1700 | 1:100 |
| GATA4 | Santa Cruz | sc-9053 | 1:100, 10 min fixation |
| GATA4 | Santa Cruz | sc-1237 | 1:100, overnight fixation |
| SOX17 | R&D | AF1924 | 1:100 |
| Nanog | ReproCELL | RCAB0002P-F | 1:500 |
| OCT4 | Santa Cruz | sc-5279 | 1:100, 10 min to overnight fixation |
| DAB2 | BD | BD-610464 | 1:200 |
| Secondary antibodies | Life Technologies | Various | 1:500 |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Imaging | |||
| 35 mm glass-bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Segmentation | |||
| Computer running 64-bit Windows OS | n/a | Verify minimal system requirements at http://katlab-tools.org and in Lou et al., (2014) Stem Cell Reports | |
| MATLAB (software) | Mathworks | n/a | |
| MINS (software) | Free | n/a | http://katlab-tools.org |
Riferimenti
- Saiz, N., Plusa, B. Early cell fate decisions in the mouse embryo. Reproduction. 145 (3), R65-R80 (2013).
- Schrode, N., Xenopoulos, P., Piliszek, A., Frankenberg, S., Plusa, B., Hadjantonakis, A. -. K. Anatomy of a blastocyst: cell behaviors driving cell fate choice and morphogenesis in the early mouse embryo. Genesis. 51 (4), 219-233 (2013).
- Saiz, N., Plusa, B., Hadjantonakis, A. -. K. Single cells get together: High-resolution approaches to study the dynamics of early mouse development. Seminars in cell & developmental biology. , (2015).
- Lou, X., Kang, M., Xenopoulos, P., Muñoz-Descalzo, S., Hadjantonakis, A. -. K. A Rapid and Efficient 2D/3D Nuclear Segmentation Method for Analysis of Early Mouse Embryo and Stem Cell Image Data. Stem Cell Reports. 2 (3), 382-397 (2014).
- Le Bin, G. C., Muñoz-Descalzo, S., et al. Oct4 is required for lineage priming in the developing inner cell mass of the mouse blastocyst. Development. 141 (5), 1001-1010 (2014).
- Schrode, N., Saiz, N., Di Talia, S., Hadjantonakis, A. -. K. GATA6 Levels Modulate Primitive Endoderm Cell Fate Choice and Timing in the Mouse Blastocyst. Developmental Cell. 29 (4), 454-467 (2014).
- Xenopoulos, P., Kang, M., Puliafito, A., Di Talia, S., Hadjantonakis, A. -. K. Heterogeneities in Nanog Expression Drive Stable Commitment to Pluripotency in the Mouse Blastocyst. Cell Reports. 10 (9), 1508-1520 (2015).
- Saiz, N., Kang, M., et al. Quantitative analyses for elucidating mechanisms of cell fate commitment in the mouse blastocyst. Proceedings of SPIE. 9334, (2015).
- Fleming, T. P. A quantitative analysis of cell allocation to trophectoderm and inner cell mass in the mouse blastocyst. Developmental biology. 119 (2), 520-531 (1987).
- Dietrich, J. -. E., Hiiragi, T. Stochastic patterning in the mouse pre-implantation embryo. Development. 134 (23), 4219-4231 (2007).
- Plusa, B., Piliszek, A., Frankenberg, S., Artus, J., Hadjantonakis, A. -. K. Distinct sequential cell behaviours direct primitive endoderm formation in the mouse blastocyst. Development. 135 (18), 3081-3091 (2008).
- Gerbe, F., Cox, B., Rossant, J., Chazaud, C. Dynamic expression of Lrp2 pathway members reveals progressive epithelial differentiation of primitive endoderm in mouse blastocyst. Developmental biology. 313 (2), 594-602 (2008).
- Nichols, J., Silva, J., Roode, M., Smith, A. Suppression of Erk signalling promotes ground state pluripotency in the mouse embryo. Development. 136 (19), 3215-3222 (2009).
- Yamanaka, Y., Lanner, F., Rossant, J. FGF signal-dependent segregation of primitive endoderm and epiblast in the mouse blastocyst. Development. 137 (5), 715-724 (2010).
- Morris, S. A., Teo, R. T. Y., Li, H., Robson, P., Glover, D. M., Zernicka-Goetz, M. Origin and formation of the first two distinct cell types of the inner cell mass in the mouse embryo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (14), 6364-6369 (2010).
- Artus, J., Panthier, J. -. J., Hadjantonakis, A. -. K. A role for PDGF signaling in expansion of the extra-embryonic endoderm lineage of the mouse blastocyst. Development. 137 (20), 3361-3372 (2010).
- Artus, J., Piliszek, A., Hadjantonakis, A. -. K. The primitive endoderm lineage of the mouse blastocyst: Sequential transcription factor activation and regulation of differentiation by Sox17. Developmental biology. 350 (2), 393-404 (2011).
- Kang, M., Piliszek, A., Artus, J., Hadjantonakis, A. -. K. FGF4 is required for lineage restriction and salt-and-pepper distribution of primitive endoderm factors but not their initial expression in the mouse. Development. 140 (2), 267-279 (2013).
- Bessonnard, S., De Mot, L., et al. Gata6, Nanog and Erk signaling control cell fate in the inner cell mass through a tristable regulatory network. Development. 141 (19), 3637-3648 (2014).
- Behringer, R. R., Gertsenstein, M., Vintersten Nagy, K., Nagy, A. . Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual. , (2014).
- Czechanski, A., Byers, C., et al. Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains. Nature Protocols. 9 (3), 559-574 (2014).
- Frankenberg, S., Shaw, G., Freyer, C., Pask, A. J., Renfree, M. B. Early cell lineage specification in a marsupial: a case for diverse mechanisms among mammals. Development. 140, 965-975 (2013).
- Artus, J., Vandormael-Pournin, S., Frödin, M., Nacerddine, K., Babinet, C., Cohen-Tannoudji, M. Impaired mitotic progression and preimplantation lethality in mice lacking OMCG1, a new evolutionarily conserved nuclear protein. Molecular and cellular biology. 25 (14), 6289-6302 (2005).
- Saiz, N., Grabarek, J. B., Sabherwal, N., Papalopulu, N., Plusa, B. Atypical protein kinase C couples cell sorting with primitive endoderm maturation in the mouse blastocyst. Development. 140 (21), 4311-4322 (2013).
